本发明属于免疫层析检测,尤其涉及一种新型胶体金法定量检测降钙素原pct免疫层析试纸条。
背景技术:
1、降钙素原(procalcitonin,pct)是由神经内分泌细胞(包括甲状腺、肺和胰腺组织的c细胞)表达的一类无激素活性的降钙素前肽物质。当严重细菌、真菌、寄生虫感染以及脓毒症和多脏器功能衰竭时它在血浆中的水平升高。研究表明:pct可能参与集体众多的生化过程,包括胚胎发育、细胞分化、炎症免疫应答、细胞凋亡、脂质代谢、肿瘤的发生发展等。pct是诊断和监测细菌炎症疾病感染的一个参数。pct作为一个急性诊断的参数的应用:(1)预示并鉴别诊断细菌性和非细菌性感染和炎症;(2)监测有感染危险的患者(如外科术后和器官移植后免疫抑制期,多处创伤后)以及需要重症监护患者,用来探测细菌感染的全身影响或检测脓毒性并发症;(3)评价严重炎症性疾病临床进程及预后,如腹膜炎、脓毒症、sirs和mods。目前,检测pct的实验室方法有很多,不仅可以定性,也可以定量评测,包括放射免疫学分析法、化学发光法、胶体金比色法等方法,其中胶体金比色法检测速度快、受限小,便于基层快检与应用推广。
2、目前有大量商品化的降钙素原检测试剂盒或者试纸条,依然存在检出限问题,灵敏度不高,检测时间长等缺陷。
技术实现思路
1、本发明旨在开发一种降钙素原pct胶体金法免疫层析定量测量试纸条,以实现快速定量检测降钙素原pct,检测灵敏度为0.01ng/ml,检出限更低,更为精确,15min快速读数。
2、本发明的技术方案为:
3、一种新型胶体金法定量检测降钙素原pct免疫层析试纸条,所述试纸条结构组成包括:pvc底板、样品垫、金标垫、硝酸纤维素膜(nc膜)和吸水垫;样品垫、金标垫、硝酸纤维素膜(nc膜)与吸水垫依次按顺序粘贴固定在pvc底板上,硝酸纤维素膜(nc膜)上固定划膜羊抗鼠igg多克隆抗体作为质控线,降钙素原单克隆抗体抗体m7413作为检测线;所述金标垫喷有降钙素原pct单克隆抗体m7413的标记金;所述抗体m7413的氨基酸序列如seq idno.1所示。
4、所述试纸条的检测线性范围为0.01ng/ml~600ng/ml。
5、本发明的试纸条的灵敏度高,主要原因是我们在现有多个配对批次中筛选出性能最优的配对组合如实施例3与实施例4所示。
6、所述的新型胶体金法定量检测降钙素原pct免疫层析试纸条的制备方法,包括如下步骤:
7、(1)将硝酸纤维素膜(nc膜)粘贴在pvc底板上,固定贴合;
8、(2)将降钙素原单克隆抗体和羊抗鼠igg多克隆抗体采用划膜机划在nc膜上固定,置于37℃的烘箱中烘干2h备用;
9、(3)标记金过程:取15ml金水,加入适量的k2co3调节金水ph8.5-10.0,加入降钙素原pct单克隆抗体m7413进行标记25~40min,之后再加入10%质量分数的bsa进行封闭25~40min,置于离心机8000~10000rmp离心25~40min,取出后去掉上清液,吸出标记好降钙素原pct单克隆抗体m7413的标记金;加入80-100ul的pct金标稀释液,测量od,计算后并采用喷金仪喷在提前准备好的金标垫上,放烘箱37℃烘干1-2h备用;
10、(4)将吸水垫、喷有降钙素原pct单克隆抗体m7413的标记金的金标垫与样品垫依次组成一起,再用胶带将样品垫与金标垫粘起来,压实,剪裁为合适大小密封保存。
11、步骤(3)中所述金水为氯金酸与柠檬酸三钠反应制备得到。所述抗体m7413的氨基酸序列如seq id no.1所示。
12、步骤2)中降钙素原单克隆抗体在nc膜上固定量为1.0mg/ml。
13、步骤2)中羊抗鼠igg多克隆抗体在nc膜上固定量为1.0mg/ml。
14、步骤3)中调节金水ph为9.4。
15、步骤4)中剪裁为3mm*80mm。
16、降钙素原pct单克隆抗体m7413的获取方法:培养、筛选细胞株,然后打到小鼠体内培养诱生,产生相应的腹水,进行纯化,测序得序列如seq id no.1所示。
17、所述的降钙素原pct单克隆抗体m7413在定量检测pct中的应用。
18、检测原理:双抗体夹心法;检测时间为15min读数,检测线性范围为0.01ng/ml~600ng/ml。降钙素原pct胶体金法免疫层析定量测量试纸条具体结构如图1所示。
19、有益效果
20、本项发明专利一种降钙素原pct胶体金法免疫层析定量测量试纸条,其优点在于:(1)制作简单,体积小,成本较低,可批量化生产;(2)读数时间短,15min便可读数,完成检测,适用于临床快速诊断与现场的快检场合;(3)易于保存,只需放入含干燥剂的铝箔袋便可长时间保存,有利于基层医疗单位使用与推广。
1.一种新型胶体金法定量检测降钙素原pct免疫层析试纸条,所述试纸条结构组成包括:pvc底板、样品垫、金标垫、硝酸纤维素膜(nc膜)和吸水垫;样品垫、金标垫、硝酸纤维素膜(nc膜)与吸水垫依次按顺序粘贴固定在pvc底板上,其特征在于,硝酸纤维素膜(nc膜)上固定划膜羊抗鼠igg多克隆抗体作为质控线,降钙素原单克隆抗体m7413作为检测线;所述金标垫喷有降钙素原单克隆抗体m7413的标记金;所述抗体m7413的氨基酸序列如seq.id.no.1所示。
2.根据权利要求1所述的新型胶体金法定量检测降钙素原pct免疫层析试纸条,其特征在于,所述试纸条的检测线性范围为0.01ng/ml~600ng/ml。
3.根据权利要求1所述的新型胶体金法定量检测降钙素原pct免疫层析试纸条,其特征在于,所述试纸条中羊抗鼠igg多克隆抗体的含量0.7-1.0mg/ml,降钙素原单克隆抗体m7413的含量0.5-1.2mg/ml。
4.权利要求1所述的新型胶体金法定量检测降钙素原pct免疫层析试纸条的制备方法,其特征在于,包括如下步骤:
5.根据权利要求4所述的新型胶体金法定量检测降钙素原pct免疫层析试纸条的制备方法,其特征在于,步骤(3)中所述金水为氯金酸与柠檬酸三钠反应制备得到。
6.根据权利要求4所述的新型胶体金法定量检测降钙素原pct免疫层析试纸条的制备方法,其特征在于,步骤2)中降钙素原单克隆抗体在nc膜上固定量为1.0mg/ml。
7.根据权利要求4所述的新型胶体金法定量检测降钙素原pct免疫层析试纸条的制备方法,其特征在于,步骤2)中羊抗鼠igg多克隆抗体在nc膜上固定量为1.0mg/ml。
8.根据权利要求4所述的新型胶体金法定量检测降钙素原pct免疫层析试纸条的制备方法,其特征在于,步骤3)中调节金水ph为9.4。
9.根据权利要求4所述的新型胶体金法定量检测降钙素原pct免疫层析试纸条的制备方法,其特征在于,步骤4)中剪裁为3mm*80mm。