一种测定高脂肪样品基质中的黄曲霉毒素预警指示物Averantin的方法

本发明属于有害污染物风险预警检测，具体涉及一种测定高脂肪样品基质中的黄曲霉毒素预警指示物averantin的方法。

背景技术：

1、黄曲霉毒素(afs)作为黄曲霉和寄生曲霉的次生代谢产物，具有致癌性和神经毒性。不仅对人类健康产生巨大的威胁，还在世界范围内造成重大的经济损失。目前，粮食中afs污染问题已成为世界各国高度关注的食品安全热点问题。afs生物合成途径共涉及多个酶促反应和至少15个稳定的前体。对afs生成的时间过程变化研究发现，部分前体与afs一起产生，先于afs达到峰值，前体含量和积累速度与随后检测到的afs水平呈正相关，与间隔时间呈负相关。根据前体与afs产生之间的时间过程关系，可将前体作为预警指示物，在一定时间范围内预测afs的发生，从而能提前采取有效措施防止afs污染产生和降低经济损失。averantin(avn)是afs合成路径中紧随norsolorinic acid(nor)之后的第二个稳定前体，处于afs生物合成中的上游，它的含量峰值出现时间早于versicolorin b(ver b)等已报道的前体(xie h,wang x,zhang l,et al.monitoring metabolite production ofaflatoxin biosynthesis by orbitrap fusion mass spectrometry and d-optimalmixture design method[j].analytical chemistry,2018,90(24):14331-14338)，有望更早预警afs的发生。对avn的准确、灵敏测定是建立avn与afs间的时间过程关系的关键，也是保证前体预警技术有效性的前提。

2、wang等采用液相色谱高分辨质谱联用仪对avn进行测定(wang x,zhao y,qi x,etal.quantitative analysis of metabolites in the aflatoxin biosynthesis pathwayfor early warning of aflatoxin contamination by uhplc-hrms combined with qams[j].journal of hazardous materials,2022,431,128531)，不过该方法所用仪器设备昂贵且需要经验丰富的操作员，另外，该方法测定的是脂肪含量低的黄曲霉菌菌丝样品基质中的avn。而afs污染广泛存在于花生、玉米、棉花、芝麻和坚果等易感作物中。按照脂肪含量超过20％即为高脂肪样品的分类原则，大部分易被afs污染的样品均为高脂肪基质(如：花生44％～54％，芝麻46％～57％，葵花籽40％～68％)。对于高脂肪基质样品，在用有机溶剂提取目标物时，脂肪等样品基体被共同提取，且很多亲脂性污染物也会在脂肪中富集，影响方法的回收率、重复性和灵敏度。凝胶渗透色谱(gpc)或固相萃取(spe)被报道用于高脂肪含量样品目标物的萃取，但往往需消耗大量有机试剂、耗费时间长且通常需要额外的净化步骤，使检测的重复性偏低和检测时间偏长，也对操作人员的身体健康和环境造成危害。液液萃取和冷冻技术操作虽相对简单，但也同样存在上述问题。quechers法是一种常被用于高脂肪含量样品的样品前处理技术，garcia-vara结合quechers和lc-ms/ms，测定了代表性高脂肪基质如橄榄和葵花籽中42种农残(garcia-vara,m,postigo,c,palma,p,etal.quechers-based analytical methods developed for lc-ms/ms multiresiduedetermination of pesticides in representative crop fatty matrices:olives andsunflower seeds[j].food chemistry,2022,386,132558)，但该方法的整个过程仍存在多次转移步骤，且所用试剂种类多，影响方法的准确度和简便性。

3、综上，由于afs易感作物如花生、玉米、芝麻和坚果样品脂肪含量高，而afs预警指示物avn含量往往极低，故需发展准确、灵敏的适用于高脂肪含量样品基质中黄曲毒素预警指示物avn的测定方法，为建立avn与afs之间的准确时间过程关系提供方法基础。

技术实现思路

1、针对高脂肪基质中亲脂性污染物等共提取物的存在，影响黄曲毒素预警指示物avn检测方法的加标回收率、灵敏度和重复性，以及样品前处理过程中消除或降低共提取物时操作繁琐复杂、耗时的问题，本发明采用简单、快速的能高效萃取avn的新型均相液液微萃取技术，与常规高效液相色谱仪-紫外检测器联用，建立了一种简单、准确、高灵敏测定高脂肪基质样品中黄曲毒素预警指示物avn的新方法，该方法具体是先通过离子液体与样品溶液形成均相溶液，离子液体能与目标物之间产生强的相互作用从而与共提取物有力竞争目标物，接着，在水和氮吹的辅助下，使离子液体萃取相分离。

2、本发明具体采用以下技术方案：

3、一种测定高脂肪样品基质中的黄曲霉毒素预警指示物averantin的方法，包括以下步骤：

4、将待检测样品粉碎，称取样品，加入提取剂甲基叔丁基醚，涡旋10～120s后，离心5～10min，透明的上清液为制备出的非水样品溶液。取非水样品溶液至锥形底离心管中，加入作为萃取剂的离子液体，形成均相溶液；在水和氮吹辅助下，使离子液体萃取相分离；抽取一定体积的沉积在下端的离子液体萃取相进入高效液相色谱仪-紫外检测器分析。其中，待检测样品、提取剂、萃取剂、水的用量比为：0.1～0.5g:1～5ml:20～45μl:1～5ml。

5、离子液体能充分溶解于样品提取液中形成均相溶液，离子液体与avn的接触面积无限大，实现两者的高效传质，且在萃取过程中avn在离子液体相和对应共提取物相进行分配，离子液体能通过强的π-π和氢键作用将avn从高脂肪基质提取液中高效萃取出来。接着，在水和氮吹的辅助下，使离子液体相和共提取物相分离，消除亲脂性污染物等共萃取物的干扰。整个萃取过程采用仅微升级的离子液体，实现微萃取。

6、其中，高效液相色谱条件为：色谱柱为c18(4.6×250mm，5μm)，进样量10μl，柱温30℃，流速1ml/min；流动相为甲醇/乙腈/水(35:35:30，v/v/v)；紫外检测波长330nm。

7、上述步骤中，氮吹的温度为40～60℃，氮吹至至离子液体萃取相从提取液中分离并沉积到下部。

8、上述步骤中，所述的水与萃取剂不互溶。所述的萃取剂离子液体需与样品溶液互溶，形成均相溶液，具体的，所用的离子液体为1-己基-3-甲基咪唑双三氟甲磺酰亚胺([hmim][tf2n])。

9、本发明的有益效果为：

10、1.本发明构建了一种简单、快速的能高效萃取高脂肪含量谷物样品中痕量污染物的新型均相液液微萃取技术，进而提出了一种能简单、准确、高灵敏测定高脂肪基质谷物样品中黄曲霉毒素预警指示物avn的新方法。

11、2.本发明采用实验室常规高效液相色谱仪-紫外检测器就能实现黄曲霉毒素预警指示物的准确、高灵敏测定，有助于afs早期预警，保障全民食品质量安全。

12、3.本发明建立的均相液液微萃取-高效液相色谱-紫外检测方法为进一步研究afs的预警技术提供了一种新的分析策略。