单个精子活性氧和精子线粒体膜电位检测系统的制作方法

本技术涉及精子分析，尤其涉及一种单个精子活性氧和精子线粒体膜电位检测系统。

背景技术：

1、活性氧（reactive oxygen species, ros）是有机体在有氧代谢过程中产生的一类含氧物质，主要包括超氧阴离子(o2·-)、过氧化氢(h2o2)、羟自由基(· oh)、活性氮类(no等)，氧化能力极强，对于精子而言具有两面性，少量、持续的活性氧刺激有利于精子发挥正常的生理功能，如细胞信号转导、激素的产生、精子获能、顶体反应以及精子活力等，但过量的活性氧将引起精子氧化应激，损伤精子的氧化防御系统，并对精子产生潜在毒性，造成精子膜的脂质过氧化及精子内蛋白质的过氧化、精子dna的损伤、精子的线粒体损伤等，严重影响精子的功能。活性氧介导的氧化应激对精子的损伤作用已被认为是男性不育的重要原因之一，因此，检测男性精液和精子中活性氧水平是诊断和辅助治疗男性不育的重要手段。

2、线粒体是细胞中的能量生产单元，其产生的能量物质atp可为精子运动提供动力，几乎整个精子代谢所需的能量也均由线粒体提供，因此线粒体的功能状态对于精子的运动和存活具有重要意义。线粒体在产生能量时，会将电化学势能储存于线粒体内膜，在内膜两侧，若质子及其他离子浓度的不对称分布就会形成线粒体膜电位（mmp），正常的mmp是维持线粒体进行氧化磷酸化、产生三磷酸腺苷的先决条件，对于维持细胞正常的生理功能至关重要，研究发现多种细胞在不同因子作用下发生凋亡时均伴有mmp的下降。在生殖细胞领域，线粒体mmp的正常水平反映了精子线粒体atp能量代谢情况良好，mmp的改变或丧失将预示着精子运动所需要的atp能量合成出现障碍，也是精子细胞发生凋亡的早期信号，已有多项研究通过对mmp的检测来评价精子的功能。

3、目前，精子活性氧检测方法主要有化学发光法和荧光探针法，精子线粒体膜电位检测主要使用的是荧光探针法。

4、精子活性氧化学发光法检测过程中使用鲁米诺或光泽精作为化学发光探针，探针和精液中的活性氧反应后会被降解而发光，使用化学发光仪（luminometer）可以定量检测精子细胞活性氧的生成，具有高度的灵敏度和特异性，但该种技术更适合精液总体（精子和精液）活性氧水平的评价，不适合单个精子内活性氧水平的检测。单个精子内活性氧水平的检测可以排除检测过程中较大背景干扰，反映精子与精子细胞之间的差异，相较于精液总体活性氧评价更有指导意义，更客观评价精子质量。

5、荧光探针法使用透膜过性荧光染色剂对精子进行染色后，使用流式细胞仪进行检测，其中精子活性氧检测使用的是dcfh-da探针，穿透精子细胞膜后，可被活性氧氧化为dcf，可受激产生绿色荧光，精子线粒体膜电位使用的是jc-1荧光探针，可线粒体的基质中聚集形成聚合物，受激后产生红色荧光。但流式细胞仪在检测过程中存在以下弊端：1）依赖于鞘液液滴包裹单个精子进行荧光水平的检测，鞘液液滴的流动剪切力可能会使得精子产生氧化应激，造成荧光检测不准确；2）有起始上样量的需求，样品损耗量大，精子样品通常还会做别的检测，如果患者精子数量稀少，不适合上机检测；3）流式细胞仪检测的是流动的单个液滴，单个液滴中包裹精子，如果单个液滴在流动过程中偏离焦平面，收集的散射荧光就会有误差，造成检测数据不准确；4）样品制备复杂，仪器需要校准，操作难度大。

6、综上所述，现有检测技术均无法准确定量检测单个精子内活性氧或线粒体膜电位的水平，主要原因是精子尺寸太小，通常只有5μm直径，缺少直接针对单个精子进行荧光激发的激发光探头，本系统采用了激发光探头和光子级别光学检测模块，实现了单个精子活性氧和精子线粒体膜电位水平的检测，是生殖细胞检测技术领域一大空白。

技术实现思路

1、本实用新型需要解决的技术问题是提供一种单个精子活性氧和精子线粒体膜电位检测系统，采用激发光探头和光子级别光学检测模块来实现单个精子活性氧和精子线粒体膜电位水平的检测。

2、为解决上述技术问题，本实用新型所采取的技术方案如下。

3、单个精子活性氧和精子线粒体膜电位检测系统，包括相配装的壳体和舱门，所述壳体内设置有放置盛装精液器皿的样品池，样品池的上方设置有能够激发器皿内目标精子荧光的激发机构，样品池的下方设置有对激发后的目标精子进行荧光收集的检测机构，壳体内设置有控制检测机构和激发机构工作的控制器，所述壳体的外部设置有与控制器输出端连接、方便查看检测结果的显示器。

4、上述单个精子活性氧和精子线粒体膜电位检测系统，所述样品池固定设置在壳体的中部，样品池的中部开设有通孔，所述器皿以覆盖通孔方式放置在样品池上。

5、上述单个精子活性氧和精子线粒体膜电位检测系统，所述激发机构包括通过连接线连接的激发光源和激发光探头，其中激发光源通过固定在壳体上部的隔板定位，激发光探头通过探头夹具夹持；激发光源的受控端连接控制器的输出端。

6、上述单个精子活性氧和精子线粒体膜电位检测系统，所述壳体的底部固定设置有步进电机模块，探头夹具设置在步进电机模块的输出端，步进电机模块的受控端与控制器的输出端连接，以在步进电机模块带动下改变探头夹具和激发光探头的位置。

7、上述单个精子活性氧和精子线粒体膜电位检测系统，所述检测机构包括设置在样品池下方的光学检测模块，光学检测模块的输出端通过数据线连接控制器的输入端。

8、上述单个精子活性氧和精子线粒体膜电位检测系统，所述检测机构还包括固定设置在壳体底部的光路切换装置，光路切换装置的顶部设置有物镜，物镜位于样品池的下方、并正对通孔位置；所述光学检测模块设置在光路切换装置的一侧，光路切换装置的另一侧设置有ccd相机，所述光路切换装置的受控端连接控制器的输出端，ccd相机的输出端通过数据线连接控制器的输入端。

9、上述单个精子活性氧和精子线粒体膜电位检测系统，位于器皿正上方和隔板下方的壳体内通过支架固定设置有明场光源，明场光源的受控端连接控制器的输出端。

10、上述单个精子活性氧和精子线粒体膜电位检测系统，所述壳体和舱门均为避光壳体。

11、上述单个精子活性氧和精子线粒体膜电位检测系统，所述激发光源为led单波长激发光源。

12、上述单个精子活性氧和精子线粒体膜电位检测系统，所述壳体的底部四脚位置分别设置有减震垫片。

13、由于采用了以上技术方案，本实用新型所取得技术进步如下。

14、本实用新型通过ccd相机视野完成精子的自动识别和标注，结合步进电机模块和光学检测模块的自动控制，将激发光探头逐次定位到单个精子附近，并完成荧光激发和荧光信号的采集，实现了多个单精子的自动化检测，提高了单个精子活性氧和线粒体膜电位的检测效率以及检测精度。

技术特征：

1.单个精子活性氧和精子线粒体膜电位检测系统，其特征在于：包括相配装的壳体（1）和舱门（17），所述壳体（1）内设置有放置盛装精液器皿（12）的样品池（11），样品池（11）的上方设置有能够激发器皿内目标精子荧光的激发机构，样品池（11）的下方设置有对激发后的目标精子进行荧光收集的检测机构，壳体内设置有控制检测机构和激发机构工作的控制器（3），所述壳体的外部设置有与控制器输出端连接、方便查看检测结果的显示器（16）。

2.根据权利要求1所述的单个精子活性氧和精子线粒体膜电位检测系统，其特征在于：所述样品池（11）固定设置在壳体的中部，样品池的中部开设有通孔，所述器皿（12）以覆盖通孔方式放置在样品池上。

3.根据权利要求1所述的单个精子活性氧和精子线粒体膜电位检测系统，其特征在于：所述激发机构包括通过连接线（5）连接的激发光源（4）和激发光探头（15），其中激发光源（4）通过固定在壳体上部的隔板（2）定位，激发光探头（15）通过探头夹具（6）夹持；激发光源（4）的受控端连接控制器（3）的输出端。

4.根据权利要求1所述的单个精子活性氧和精子线粒体膜电位检测系统，其特征在于：所述壳体的底部固定设置有步进电机模块（14），探头夹具（6）设置在步进电机模块（14）的输出端，步进电机模块（14）的受控端与控制器的输出端连接，以在步进电机模块（14）带动下改变探头夹具（6）和激发光探头（15）的位置。

5.根据权利要求1所述的单个精子活性氧和精子线粒体膜电位检测系统，其特征在于：所述检测机构包括设置在样品池（11）下方的光学检测模块（8），光学检测模块（8）的输出端通过数据线连接控制器（3）的输入端。

6.根据权利要求5所述的单个精子活性氧和精子线粒体膜电位检测系统，其特征在于：所述检测机构还包括固定设置在壳体底部的光路切换装置（7），光路切换装置（7）的顶部设置有物镜（10），物镜（10）位于样品池的下方、并正对通孔位置；所述光学检测模块（8）设置在光路切换装置（7）的一侧，光路切换装置（7）的另一侧设置有ccd相机（9）；所述光路切换装置（7）的受控端连接控制器的输出端，ccd相机（9）的输出端通过数据线连接控制器（3）的输入端。

7.根据权利要求1所述的单个精子活性氧和精子线粒体膜电位检测系统，其特征在于：位于器皿正上方和隔板下方的壳体内通过支架固定设置有明场光源（13），明场光源（13）的受控端连接控制器（3）的输出端。

8.根据权利要求1所述的单个精子活性氧和精子线粒体膜电位检测系统，其特征在于：所述壳体（1）和舱门（17）均为避光壳体。

9.根据权利要求3所述的单个精子活性氧和精子线粒体膜电位检测系统，其特征在于：所述激发光源（4）为led单波长激发光源。

10.根据权利要求1所述的单个精子活性氧和精子线粒体膜电位检测系统，其特征在于：所述壳体的底部四脚位置分别设置有减震垫片（18）。

技术总结
本技术公开了一种单个精子活性氧和精子线粒体膜电位检测系统，包括相配装的壳体和舱门，所述壳体内设置有放置盛装精液器皿的样品池，样品池的上方设置有能够激发器皿内单个精子荧光的激发机构，样品池的下方设置有对激发后的精子进行活性氧和线粒体膜电位检测的检测机构，壳体内设置有控制检测机构和激发机构工作的控制器；所述壳体的外部设置有与控制器输出端连接、方便查看检测结果的显示器。本技术采用激发光探头和光子级别光学检测模块实现了单个精子活性氧和精子线粒体膜电位水平的检测，具有灵敏、准确、自动、快速的优点。

技术研发人员：徐艇,郭正飞
受保护的技术使用者：无锡瑞思医疗科技有限公司
技术研发日：20220324
技术公布日：2024/1/11