免疫测定法的制作方法

本发明涉及用于鉴定一种或多种类型的游离轻链的免疫测定法。

背景技术：

1、抗体由两条相同的重链和两条相同的轻链组成，每条链都包含可变结构域和恒定结构域。轻链有两种类型：kappa(κ)和lambda(λ)。每种抗体只表达一类轻链。通常，轻链附着在重链上，然后称为结合轻链。然而，通常会有一些多余的轻链不与重链结合，这些轻链被称为“游离轻链”(flc)。flc是可检测的，例如可以在个体的血清、血浆或尿液中检测到。

2、血清游离轻链(sflcs)是诊断和治疗免疫相关疾病的重要生物标志物，例如郁结型多发性骨髓瘤(smm)、多发性骨髓瘤(mm)和其他浆细胞疾病，例如意义未定的单克隆丙种球蛋白病(mgus)、轻链淀粉样变性(al-淀粉样变性)和轻链沉积病(lcdd)。它们也是免疫刺激疾病的标志物，例如多发性硬化症、某些肝脏疾病和自身免疫性疾病，例如系统性红斑狼疮(sle)。

3、正常和异常浆细胞产生的轻链多于重链，这些多余的轻链被释放到血液中。这些flcs通常被快速清除并被肾脏代谢。sflcs增加可能是由于肾清除率降低、多克隆免疫球蛋白产生增加或单克隆丙种球蛋白病所致。

4、flcs可以通过在flcs表面产生抗体来检测，在全分子免疫球蛋白中，flcs通常通过轻链与重链的结合而隐藏。先前已公开了产生针对flcs的哺乳动物抗体的方法(bradwell等人，clin.chem.，(2001)，47，673-680)。

5、免疫测定是基于测量抗原(例如蛋白质上的位点)和对该抗原具有特异性的抗体之间的反应。游离轻链的检测可以通过免疫测定进行，其中针对flc区域中的至少一种抗原产生抗体，该抗原与完整抗体中的重链结合。市售有用于检测κ或λflcs的试剂盒，例如thebinding site limited生产的“freelitetm”和siemens生产的“n latex”。这些分别基于多克隆绵羊抗体技术和多种单克隆抗体。

6、当前sflc检测的一个问题是它们不可互换，因为不同的检测方法可能对同一样品提供不同的结果。flcs检测被报道的一个问题是，已知这些分子是异质群体，表现出相当大的差异，并且通常以聚合形式存在于血液、血清、血浆和尿液中。这些可以是例如二聚体、四聚体或更高的聚合形式。κflcs通常作为单体被发现，而λflcs倾向于形成二聚体(scand.j.clin.lab.invest.,(1976),36,447-452)。除非抗flc抗体以等摩尔方式识别所有分子形式，否则sflc测定不会在所有样品中给出等效的结果。caponi等人(clin.chem.lab.med.,(2016),54,1111-1113)强调了现有flc检测之间的这种差异。

7、健康个体与单克隆丙种球蛋白病或其他免疫刺激疾病患者的血清flc单体/二聚体比率也可能不同。例如，kaplan等人(am.j.hematol.,(2014),89,882-888)表明，al和mm患者表现出单克隆flc二聚化异常增加，同时伴随flc二聚体克隆值高于单体。在mgus、smm、al淀粉样变性患者和健康人中均未观察到这些flc模式异常。

8、第一个sflc测定的开发者考虑了flc分子的聚合变异的重要性(bradwell等人，clin.chem.,(2001),47,673-680)。然而，已发表的数据显示，所产生的抗体与二聚体形式的结合比与单体形式结合的亲和力更大。因此预期使用bradwell等人描述的哺乳动物来源的多克隆抗体产生的免疫测定将优先识别flc的二聚体形式。

9、研究表明，freelite和n-latex检测都大大高估了单克隆flc的浓度，尤其是在滴度较高的样品中，并且已证明flc聚合是原因(de kat angelino cm等人，2010.clinchem.2010jul；56(7):1188-90.,和di noto get等人,ann clin biochem.2015may；52(3):327-36)。

10、目前还没有国际公认的flc参考材料或参考方法。目前市售的flc测定方法及其对具有不同多聚形式flc的样品的响应存在显着差异。

11、已经提出了一些策略来减轻使用哺乳动物衍生抗体对多聚体flcs的定量，包括在测定配方中(wo2017144896a1)使用还原剂选择性裂解轻链间(l-l)链二硫键(jerry和kunkel，j immunol，1972年11月1日，109)5)982-991)。然而，这些策略需要额外的步骤和/或增加测定的复杂性，并且此类方法尚未成功应用。

12、能够在更少依赖于样品的聚合/多聚体状态的情况下量化flcs非常重要。提供对多聚体形式的依赖性更少的特异性检测λ或κflc的测定法也是有利的。flc抗体必须仅识别全免疫球蛋白中“隐藏”的表位，以避免因与全免疫球蛋白中的轻链发生交叉反应而导致flc假性升高。

13、本发明人已发现基于禽源抗体(igy)的免疫测定试剂解决了与flcs的不同多聚体形式相关的问题。

技术实现思路

1、发明概述

2、在第一方面，提供了用于测定哺乳动物样品中的flcs的方法，包括使用至少一种禽源抗体(igy)。

3、在第二方面，提供了用于筛选、诊断、监测或预后患者疾病的方法，包括进行第一方面中描述的测定方法并将测定结果与至少一个预定阈值进行比较。

4、在第三方面，提供了禽源抗体(igy)在测定哺乳动物样品中的flcs的免疫测定中的用途。

5、在第四方面，提供了包含至少一种禽源抗体的测定试剂盒，用于测定哺乳动物样品中的flcs。

6、本文描述了本发明的各种实施方案，在技术上可行的情况下，适用于本发明的所有方面。在技术上可行的情况下，本文所述的所有实施方案可单独使用，也可与所有其他实施方案结合使用。

7、在一个实施方案中，禽源抗体是鸡抗体。

8、在另一个实施方案中，样本是血清、血浆或尿液。

9、在另一个实施方案中，flc为λ、κ或总flcs。

10、在另一个实施方案中，该疾病选自郁结性多发性骨髓瘤、完整免疫球蛋白骨髓瘤、轻链骨髓瘤、非分泌性骨髓瘤、意义未定的单克隆丙种球蛋白病(mgus)、轻链淀粉样变性(al淀粉样变性)、华氏巨球蛋白血症、霍奇金淋巴瘤、滤泡中心细胞淋巴瘤、慢性淋巴细胞白血病、套细胞淋巴瘤、前b细胞白血病或急性淋巴细胞白血病。

11、在一些实施方案中，禽源抗体附着至支持材料。

12、本发明进一步的特征和优点将通过以下仅以示例的方式给出的描述并参考相应的附图变得显而易见。

技术特征：

1.一种用于测定哺乳动物样品中的游离轻链flcs的方法，包括使用至少一种禽源抗体(igy)。

2.根据权利要求1所述的方法，其中所述igy对至少一种哺乳动物免疫球蛋白轻链的恒定结构域表现出亲和力。

3.根据权利要求1或权利要求2所述的方法，其中所述igy被标记。

4.根据权利要求3所述的方法，其中所述igy通过荧光、发光、放射性、同位素标记或与酶、颗粒或底物共轭标记。

5.根据权利要求1至4所述的方法，其中所述igy被固定在颗粒或表面上。

6.根据权利要求5所述的方法，包括使用包含作为结合剂的固定igy的生物传感器。

7.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述测定方法是浊度测定、比浊测定、流式细胞法、侧流测定、免疫固定电泳(ife)或酶联免疫吸附测定(elisa)测定。

8.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述测定方法是比浊测定。

9.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述igy涂覆在平均直径为至少40nm、例如50至160nm的纳米颗粒上。

10.根据权利要求1至7中任一项所述的方法，其中所述测定是elisa测定。

11.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述igy特异性结合(或能够特异性结合)λ(lambda)或κ(kappa)flc。

12.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述flc是λ(lambda)、κ(kappa)或总flc。

13.根据前述权利要求中任一项所述的方法，包括使用至少两种具有不同特异性的igy，其中一种对λflc具有较高的亲和力，另一种对κflc具有较高的亲和力。

14.根据权利要求1至13中任一项所述的方法，包括使用至少两种具有不同特异性的igy，其中一种对λflc或κflc具有较高的亲和力，而另一种igy对λflc和κflc具有基本相同的亲和力。

15.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中测定了κflc与λflc的比率(flcκ:λ)。

16.根据权利要求15所述的方法，其中将所述flcκ:λ比率与flcκ:λ的正常范围进行比较，计算得到的正常范围的任何显著性(例如，>10％或>5％)偏差，和与正常范围增加的偏差与疾病进展前景增加和/或预后恶化相关。

17.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述igy与flc的单体和二聚体形式具有基本相等的反应性。

18.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述igy与flc的所有多聚体形式具有基本相等的反应性。

19.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述哺乳动物样品是血液、血清、血浆、唾液、尿液或脑脊液或其他生物液体的样品，优选血清、血浆或尿液。

20.一种用于筛选、诊断、监测或预后患者疾病的方法，包括进行权利要求1至19中任何一项要求的测定方法，并将测定结果与至少一个预定阈值进行比较和/或计算测定结果与正常范围的偏差。

21.根据权利要求20所述的方法，其中所述疾病是b细胞相关疾病。

22.根据权利要求21所述的方法，其中所述疾病选自郁结性多发性骨髓瘤、完整免疫球蛋白骨髓瘤、轻链骨髓瘤、非分泌性骨髓瘤、意义未明的单克隆丙种球蛋白病(mgus)、轻链淀粉样变性(al淀粉样变性)、华氏巨球蛋白血症、霍奇金淋巴瘤、滤泡中心细胞淋巴瘤、慢性淋巴细胞白血病、套细胞淋巴瘤、前b细胞白血病或急性淋巴细胞白血病。

23.禽源抗体(igys)在测定哺乳动物样品中的flcs的免疫测定中的用途。

24.如权利要求1所述的测定方法或权利要求1至19中任何一项的用途。

25.至少一种禽源抗体(igy)在制造用于测定哺乳动物样品中的flcs的测定试剂盒中的用途。

26.一种用于根据权利要求1至22任一项所述方法的测定试剂盒。

27.一种测定试剂盒，包含至少一种禽源抗体，用于测定哺乳动物样品中的flcs。

28.根据权利要求26或27所述的测定试剂盒，进一步包含至少一种flc参考样品。

29.根据权利要求26、27或28所述的测定试剂盒，其中所述igy附着于底物。

技术总结
本发明涉及用于鉴定一种或多种类型的游离轻链的免疫测定法。具体地，本发明涉及一种用于测定哺乳动物样品中的游离轻链FLC的方法，包括使用至少一种禽源抗体(IgY)。本发明还涉及一种用于筛选、诊断、监测或预后患者疾病的方法，包括进行所述测定方法。本发明还涉及禽源抗体(IgY)在测定哺乳动物样品中的FLC的免疫测定中的用途。

技术研发人员：A·坎贝尔
受保护的技术使用者：纳巴斯股份有限公司
技术研发日：
技术公布日：2024/9/17