一种检测兽药奥芬达唑的试纸条及方法与流程

本发明涉及一种检测兽药奥芬达唑的试纸条及方法，具体涉及一种用于检测兽药奥芬达唑的胶体金试纸条，其特别适用于液体乳中奥芬达唑残留的检测。

背景技术：

1、奥芬达唑(oxfendazole，ofz)是一种高效、广谱、低毒的苯并咪唑氨基甲酸酯类抗蠕虫药物，又称砜苯咪唑或磺苯咪唑，为芬苯达唑硫原子上的氧化物，其化学名称为5-苯-2-苯并咪唑-氨基甲酸甲酯。于70年代初由美国新泰克斯公司最先研制成功，《英国兽药典》(1985年版)已收载。目前已被广泛用于家畜、家禽驱虫。研究表明，连续或过量的用药会造成奥芬达唑在动物体内的残留，并会随着食物链进行蓄积和传递，对人类健康构成威胁。随着人们对食品安全的日益重视，动物源性食品中药物残留的限量要求也日益严格。我国国家标准gb 31650中规定了牛/羊奶中奥芬达唑的最大残留限量为100μg/kg。

2、目前已报道的检测奥芬达唑的方法主要是气相色谱法、高效液相色谱法、气相色谱质谱法和液相色谱质谱法等仪器方法。这些方法均须在实验室条件下操作，样品前处理繁琐费时，还需配备昂贵的仪器设备，检测成本较高、耗时长、操作复杂，在实际应用过程中有很大的限制性，难以满足大量样品和现场样品快速检测的需要。因此，开发一种简单快速、适于液体乳中奥芬达唑残留的胶体金试纸条，可满足大量样品现场筛选和监控，能够更好地满足我国食品监管部门等开展检测工作。

技术实现思路

1、本发明的目的在于提供一种能够检测液体乳中兽药奥芬达唑残留的胶体金试纸条，并且提供一种高效、准确、简便、适于现场监控和大量样本筛查的检测方法。

2、本发明所提供的检测奥芬达唑的试纸条，包括试纸和微孔试剂；所述试纸包括底板、样品吸收垫、反应膜、吸水垫，其依次连接，所述反应膜上具有包被有奥芬达唑半抗原-载体蛋白偶联物的检测线和包被有羊抗鼠抗抗体的质控线；所述微孔试剂上冻干有奥芬达唑单克隆抗体-胶体金标记物，其具有微孔塞。

3、所述奥芬达唑单克隆抗体是以奥芬达唑半抗原-载体蛋白偶联物作为免疫原制备获得。

4、所述奥芬达唑半抗原-载体蛋白偶联物由奥芬达唑半抗原与载体蛋白偶联得到，所述载体蛋白为牛血清白蛋白、卵清白蛋白、血蓝蛋白、甲状腺蛋白或人血清白蛋白，所述奥芬达唑半抗原是以奥芬达唑ep杂质c为起始原料，经与对羧基苯甲醛进行缩合反应，再经硼氢化钠还原得到，其分子结构式为：

5、

6、所述底板为pvc底板或其他硬质不吸水的材料；所述样品吸收垫为聚酯纤维或玻璃纤维材质；所述吸水垫为吸水滤纸；所述反应膜为硝酸纤维素膜或醋酸纤维素膜。

7、本发明的另一个目的是提供一种制备上述试纸条的方法，其包括步骤：

8、1)制备冻干有奥芬达唑单克隆抗体-胶体金标记物的微孔试剂；

9、2)制备具有包被有奥芬达唑半抗原-载体蛋白偶联物的检测线和包被有羊抗鼠抗抗体的质控线的反应膜；

10、3)将2)制备好的反应膜与样品吸收垫、吸水垫、底板组装成试纸；

11、4)将1)和3)制备好的冻干有奥芬达唑单克隆抗体-胶体金标记物的微孔试剂和试纸组装成试纸条。

12、具体地说，步骤包括：

13、1)以奥芬达唑ep杂质c为起始原料，经与对羧基苯甲醛进行缩合反应，再经硼氢化钠还原，制备奥芬达唑半抗原；

14、2)将奥芬达唑半抗原与载体蛋白偶联，制备奥芬达唑半抗原-载体蛋白偶联物；

15、3)用奥芬达唑半抗原-载体蛋白偶联物免疫小鼠，将小鼠脾细胞和小鼠骨髓瘤细胞通过融合、筛选，得到分泌奥芬达唑单克隆抗体的杂交瘤细胞株；

16、4)提取小鼠igg免疫健康山羊，得到羊抗鼠抗抗体；

17、5)分别将奥芬达唑半抗原-载体蛋白偶联物和羊抗鼠抗抗体包被于反应膜的检测线(t)和质控线(c)上；

18、6)用柠檬酸三钠与氯金酸反应制备胶体金；

19、7)将制备的奥芬达唑单克隆抗体加入到制备的胶体金中，得到奥芬达唑单克隆抗体-胶体金标记物；

20、8)将奥芬达唑单克隆抗体-胶体金标记物冻干在微孔试剂中后，将微孔试剂加上微孔塞；

21、9)将样品吸收垫用含1％牛血清白蛋白、ph为7.2的0.2mol/l磷酸盐缓冲液浸泡2h，37℃烘干2h备用；

22、10)在底板上按顺序粘贴上样品吸收垫、反应膜、吸水垫，最后切成3.95mm宽的小条；

23、11)将制备好的微孔试剂和试纸组装成试纸条，2～8℃条件下保存12个月。

24、本发明的另一个目的是提供一种应用上述试纸条检测液体乳中奥芬达唑残留的方法，它包括步骤：

25、(1)样品前处理；

26、(2)用试纸条进行检测；

27、(3)分析检测结果。

28、本发明的奥芬达唑快速检测试纸条采用高度特异性的抗体抗原反应及免疫层析分析技术，将奥芬达唑单克隆抗体-胶体金标记物冻干在微孔试剂中，样品中的奥芬达唑先与其充分反应，形成药物-抗体-胶体金标记物；再插入试纸条，样本中的药物在流动过程中与反应膜检测线上的奥芬达唑半抗原-载体蛋白偶联物竞争结合奥芬达唑单克隆抗体-胶体金标记物，根据检测线红色条带深浅来判断待测样品液中是否含有奥芬达唑残留。

29、检测时，样品经处理后滴入微孔试剂内，充分反应后再将试纸条插入微孔中，当奥芬达唑在样品中的浓度低于检测限或为零时，单克隆抗体-胶体金标记物在层析过程中会与固定在反应膜上的奥芬达唑半抗原-载体蛋白偶联物结合，在检测线(t)和质控线(c)上各出现一条红色条带，且t线显色比c线显色深或与c线显色一致；如果奥芬达唑在样品中的浓度等于或高于检测限，单克隆抗体-胶体金标记物会与奥芬达唑全部结合，从而在t线处因为竞争反应不会与奥芬达唑半抗原-载体蛋白偶联物结合而不出现红色条带或比c线显色浅。如图4所示。

30、阴性：当质控线(c)显示出红色条带，检测线(t)同时也显示出红色条带，且(t)线颜色接近或深于(c)线时，判为阴性。

31、阳性：当质控线(c)显示出红色条带，而检测线(t)不显色或(t)线颜色浅于(c)线时，判为阳性。

32、无效：当质控线(c)不显示出红色条带，则无论检测线(t)显示出红色条带与否，该试纸条均判为无效。

33、本发明的试纸条具有灵敏度高、特异性强、成本低、操作简单、检测时间短、适合各种单位使用、储存简单、保质期长的优点。其中，采用高特异性的奥芬达唑单克隆抗体，保证了检测结果的可靠性；将金标抗体冻干在微孔试剂中，在检测过程中，能够使金标抗体与待检样品液充分接触，充分反应，从而减少误差，增加整个体系的反应灵敏度。用本发明试纸条检测奥芬达唑的方法简便、快速、直观、准确、适用范围广、成本低、易推广使用。

技术特征：

1.一种检测奥芬达唑的试纸条，包括试纸和微孔试剂，所述试纸包括反应膜、样品吸收垫、吸水垫和底板，所述反应膜上具有包被有奥芬达唑半抗原-载体蛋白偶联物的检测线和包被有羊抗鼠抗抗体的质控线，所述微孔试剂上冻干有奥芬达唑单克隆抗体-胶体金标记物；所述奥芬达唑单克隆抗体是以奥芬达唑半抗原-载体蛋白偶联物作为免疫原制备获得；所述奥芬达唑半抗原-载体蛋白偶联物由奥芬达唑半抗原与载体蛋白偶联得到，所述载体蛋白为牛血清白蛋白、卵清白蛋白、血蓝蛋白、甲状腺蛋白或人血清白蛋白，其特征在于所述奥芬达唑半抗原是以奥芬达唑ep杂质c为起始原料，经与对羧基苯甲醛进行缩合反应，再经硼氢化钠还原得到，其分子结构式为：

2.如权利要求1所述的试纸条，其特征在于所述试纸由样品吸收垫、反应膜、吸水垫依次黏贴在底板上组成，所述微孔试剂上具有微孔塞。

3.一种制备权利要求1-2任一项所述试纸条的方法，其包括步骤：

4.一种检测液体乳中奥芬达唑残留的方法，其包括步骤：

技术总结
本发明公开了一种检测兽药奥芬达唑的试纸条及方法。该试纸条包括试纸和微孔试剂，所述试纸包括反应膜、样品吸收垫、吸水垫和底板，所述反应膜上具有包被有奥芬达唑半抗原‑载体蛋白偶联物的检测线和包被有羊抗鼠抗抗体的质控线，所述微孔试剂上冻干有奥芬达唑单克隆抗体‑胶体金标记物。用本发明试纸条检测奥芬达唑的方法简便、快速、直观、准确、便于携带、适用范围广、成本低、易推广使用。

技术研发人员：刘兴举
受保护的技术使用者：北京赛必达科技有限公司
技术研发日：
技术公布日：2024/1/11