分离测定卡左双多巴缓释片中杂质肼的衍生化HPLC法的制作方法

本发明属于分析化学，具体涉及一种分离测定卡左双多巴缓释片中杂质肼的衍生化hplc法。

背景技术：

1、肼为2a类致癌物质，与卡比多巴原料药相比，卡左双多巴缓释片中存在杂质肼且降解也会产生杂质肼，因此需要对卡左双多巴缓释片中的杂质肼进行控制。ep标准中，规定杂质肼含量不得过20ppm。根据卡左双多巴控释片用法用量，成品中规定杂质肼限度不得过0.0097％。

2、目前对杂质肼定量检测的报道较少，针对制剂成品中，存在大量辅料干扰的情况下，对肼的定量检测更加困难。ep标准对卡比多巴原料药中杂质肼的检测采用薄层色谱法，过程相对繁杂，需要过树脂、除氧、点板等一系列操作，且仅能通过比较供试品与对照品斑点颜色深浅，判断供试品是否合格，无法实现肼的含量测定。

3、因此，亟需开发一种高灵敏度和准确度的方法来实现卡左双多巴缓释片中杂质肼的定性鉴别和定量测定。

技术实现思路

1、有鉴于此，本发明的目的之一在于提供一种利用衍生化高效液相色谱法分离杂质肼的方法，该方法灵敏度高，准确性高，可为卡左双多巴缓释片中杂质肼的定性和定量测定提供技术支持。

2、为实现上述目的，本发明采用以下技术方案：

3、利用衍生化高效液相色谱法分离杂质肼的方法，被分离的组分为杂质肼；所述方法为：利用衍生剂对样品进行衍生化处理，制得待测溶液；所述待测溶液采用高效液相色谱法进行分离，所述高效液相色谱法的色谱柱以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂，流动相为edta溶液和乙腈的混合溶液，利用所述高效液相色谱法，通过等度洗脱在15min内将杂质肼的衍生物进行分离；所述流动相中，edta溶液和乙腈的体积比为32-38：68-62；所述衍生剂为苯甲醛的甲醇溶液。

4、由于肼没有紫外吸收，本专利采用衍生的方法，利用杂质肼与苯甲醛衍生生成二苄肼衍生物，对衍生物二苄肼进行hplc测定，得到肼的含量。

5、进一步，所述edta溶液含量优选为0.03％。

6、进一步，所述样品为卡左双多巴缓释片，所述卡左双多巴缓释片中含有杂质肼。

7、进一步，所述样品依次采用稀释剂、衍生剂和三乙胺的组合作为配制溶剂，制得所述待测溶液；所述待测溶液中含有二苄肼。

8、进一步，所述稀释剂为盐酸溶液。

9、进一步，所述稀释剂配制方法为：取浓盐酸9ml，加新沸冷水100ml，摇匀，置冰水浴中待用。

10、作为优选，所述流动相中，edta溶液和乙腈的体积比为35：65。

11、作为优选，所述色谱柱为agilent zorbax sb-c18，4.6mm×250mm，5μm或效能相当的色谱柱。

12、优选地，所述流动相流速为0.9-1.1ml/min，更优选为1ml/min。

13、优选地，所述色谱柱柱温为23-27℃，更优选为25℃。

14、优选地，进样器温度为5℃。

15、优选地，进样体积20μl。

16、本发明的目的之二在于提供一种基于目的一所述的方法检测卡左双多巴缓释片中杂质肼含量的方法，该方法可在30min内或大于30min的时间实现卡左双多巴缓释片中杂质肼的含量测定。

17、为实现上述目的，本发明采用以下技术方案：

18、基于目的一所述的方法检测卡左双多巴缓释片中杂质肼含量的方法，利用目的一所述的方法分离左双多巴缓释片中的杂质肼，分离后用波长为300nm的检测器进行检测。

19、进一步，根据所述检测器检测出的峰面积，采用外标法计算所述卡左双多巴缓释片中杂质肼的含量；具体包括以下步骤：

20、步骤1.配制样品溶液：取本品研细，取细粉75mg(相当于含卡比多巴12.5mg)，精密称定，置25ml量瓶中，置冰水浴中，加稀释剂5ml，振摇使溶解后，立即加入苯甲醛的甲醇溶液(6g→100ml，置冰水浴中待用)10ml，振摇10秒，立即加入三乙胺5ml，摇匀，用三乙胺稀释至刻度，摇匀，滤过，取续滤液作为样品溶液；

21、步骤2.配制对照品溶液：取硫酸肼适量，精密称定，加稀释剂超声溶解并定量稀释制成每1ml约含肼0.25μg的溶液，精密量取5ml，置25ml量瓶中，加苯甲醛的甲醇溶液(6g→100ml，置冰水浴中待用)10ml，振摇10秒，加入三乙胺5ml，摇匀后用三乙胺稀释至刻度，摇匀即得对照品溶液；

22、步骤3.取步骤1和步骤2的溶液，如20μl，注入高效液相色谱仪，记录色谱图，按外标法以峰面积计算卡左双多巴缓释片中杂质肼的含量。

23、作为优选，采用以下色谱条件进行等度洗脱并得到色谱图：所述流动相中edta溶液和乙腈的体积比为36：65；所述色谱柱规格为4.6mm×250mm×5μm；所述流动相流速为1ml/min；所述色谱柱柱温为25℃；进样器温度为5℃；进样体积20μl；检测波长为300nm。

24、优选地，保留时间为12.015±0.5min的为二苄肼。

25、根据保留时间对卡左双多巴缓释片中的杂质肼进行定性。

26、优选地，所述杂质肼的定量限浓度为0.005μg/ml，检测限浓度为0.0017μg/ml。

27、进一步，配置标准品，得标准样品色谱图；测试样品所得色谱图，按外标法以峰面积进行计算。

28、所述标准品为已知组份含量，所述测试样品组份含量为未知；检测得到的标准样品色谱图可以储存于数据库中，作为智慧药厂中质量控制的图谱素材，用于帮助机器人判定其生产的产品是否合格，同时对不合格的产品给出可定量的改进分析建议。

29、本发明的有益效果在于：

30、1.本专利采用游离肼与苯甲醛衍生反应的原理，同时结合卡比多巴的性质，经过优化，建立了高灵敏度的hplc方法，对成品中的游离肼进行定量分析；本发明的hplc方法定入卡左双多巴缓释片成品质量标准，专门用于检测卡左双多巴缓释片制剂成品中肼含量的检测。

31、2.本发明方法对样品处理及检测简单快速，从样品处理到结果测定，通常只需20min左右；从进样到实现含量测定，更是可在15min内完成；本发明方法操作性强，结果准确，成品片剂中的辅料不影响测定，灵敏度高，低至0.001％。

技术特征：

1.利用衍生化高效液相色谱法分离杂质肼的方法，其特征在于，被分离的组分为杂质肼；所述方法为：利用衍生剂对样品进行衍生化处理，制得待测溶液；所述待测溶液采用高效液相色谱法进行分离，所述高效液相色谱法的色谱柱以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂，流动相为edta溶液和乙腈的混合溶液，利用所述高效液相色谱法，通过等度洗脱在15min内将杂质肼的衍生物进行分离；所述流动相中，edta溶液和乙腈的体积比为32-38：68-62；所述衍生剂为苯甲醛的甲醇溶液。

2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述样品为卡左双多巴缓释片，所述卡左双多巴缓释片中含有杂质肼。

3.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，所述样品依次采用稀释剂、衍生剂和三乙胺的组合作为配制溶剂，制得所述待测溶液；所述待测溶液中含有二苄肼。

4.根据权利要求3所述的方法，其特征在于，所述稀释剂为盐酸溶液。

5.基于权利要求1-4任一项所述的方法检测卡左双多巴缓释片中杂质肼含量的方法，其特征在于，利用权利要求1-4任一项所述的方法分离左双多巴缓释片中的杂质肼，分离后用波长为300nm的检测器进行检测。

6.根据权利要求5所述的方法，其特征在于，根据所述检测器检测出的峰面积，采用外标法计算所述卡左双多巴缓释片中杂质肼的含量。

7.根据权利要求5所述的方法，其特征在于，采用以下色谱条件进行等度洗脱并得到色谱图：所述流动相中edta溶液和乙腈的体积比为36：65；所述色谱柱规格为4.6mm×250mm×5μm；所述流动相流速为1ml/min；所述色谱柱柱温为25℃；进样器温度为5℃；进样体积20μl；检测波长为300nm。

8.根据权利要求7所述的方法，其特征在于，保留时间为12.015±0.5min的为二苄肼。

9.根据权利要求7所述的方法，其特征在于，所述杂质肼的定量限浓度为0.005μg/ml，检测限浓度为0.0017μg/ml。

10.根据权利要求7所述的方法，其特征在于，配置标准品，得标准样品色谱图；测试样品所得色谱图，按外标法以峰面积进行计算。

技术总结
本发明属于分析化学技术领域，具体涉及一种分离测定卡左双多巴缓释片中杂质肼的衍生化HPLC法。本发明利用苯甲醛的甲醇溶液对样品进行衍生化处理，制得待测溶液；待测溶液采用高效液相色谱法进行分离，具体的，色谱柱采用十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂，流动相为EDTA溶液和乙腈的混合溶液，流动相中EDTA溶液和乙腈的体积比为32‑38：68‑62；通过洗脱将杂质肼的衍生物进行分离，进入检测波长为300nm的检测器进行测定。本发明方法操作性强，结果准确，成品片剂中的辅料不影响测定，灵敏度高，低至0.001％。

技术研发人员：张家维,谭辉,沈耀宗,刘阔
受保护的技术使用者：重庆华邦制药有限公司
技术研发日：
技术公布日：2024/8/1