一种蛋白质唾液酸的鉴定和验证方法与流程

本发明属于蛋白质结构精准解析，尤其涉及一种蛋白质唾液酸的鉴定和验证方法。

背景技术：

1、糖基化是人体内最丰富的蛋白质翻译后修饰之一，糖蛋白结构的精准解析是理解其生化性质和生理功能的必要条件。作为广泛存在于糖蛋白修饰支链末端的单糖，唾液酸在人体各生物识别过程中发挥着关键作用。

2、高分辨质谱的普遍推广使用使得含唾液酸n-连接糖蛋白的分析在完整n-糖肽水平上可以获得同位素分辨以及一级质谱图中前体离子和二级质谱图中碎片离子同位素轮廓的准确测量。基于这一进展和特点，本发明提供一种含唾液酸完整n-糖肽的解析方法。

技术实现思路

1、为解决上述技术问题，本发明的目的在于提供一种蛋白质唾液酸的鉴定和验证方法，该方法基于唾液酸在单糖、单糖序列以及糖蛋白质组三个分子水平上的结构指纹的靶向筛选实现含唾液酸完整n-糖肽的选择性搜索，节省搜索时间，大大提高了含唾液酸完整n-糖肽解析的准确度和效率。

2、为实现上述技术目的，达到上述技术效果，本发明通过以下技术方案实现：

3、一种蛋白质唾液酸的鉴定和验证方法，包括如下步骤：

4、s1、从待解析生物样本中制备完整n-糖肽样本；

5、s2、完整n-糖肽样本经电喷雾电离后得到前体离子，将前体离子送入质谱仪，得到包含前体离子同位素轮廓指纹的实验一级质谱图；

6、s3、将前体离子的同位素轮廓指纹与对应的靶向正向理论数据库进行匹配，筛选出符合匹配条件的具有相同分子组成的初级候选完整n-糖肽ids；

7、s4、将前体离子送入离子阱中进行气相解离得到碎片离子，将碎片离子送入质谱仪，得到包含碎片离子同位素轮廓指纹的二级质谱图；

8、s5、对初级候选完整n-糖肽ids的实验和理论碎片离子的分子组成指纹进行逐一同位素轮廓指纹比对和匹配；

9、s6、自分子组成指纹相同的初级候选完整n-糖肽ids中靶向地筛选含唾液酸特征氧鎓离子和单糖序列实验结构诊断碎片离子，并将筛选出的初级候选完整n-糖肽ids归类为候选完整n-糖肽ids；

10、s7、对候选完整n-糖肽ids进行随机匹配概率打分，最后将符合预先设定的完整n-糖肽谱图匹配条件的ids归结为靶向gpsms；

11、s8、在诱饵库中按照s3-s7的步骤，获得诱饵gpsms；

12、s9、将靶向gpsms和诱饵gpsms组合，并按p score从小到大排序，选取一个阈值pscore，使得假阳性率不大于1％，对p score不大于阈值p scor e的靶向gpsms去重，获得含唾液酸完整n-糖肽ids。

13、进一步的，所述待解析生物样本为含有唾液酸化糖蛋白的样本。

14、进一步的，步骤s2中，在进行电喷雾电离和质谱分析之前，先对完整n-糖肽样本进行液相分离。

15、进一步的，前体离子的实验分子组成指纹在一级质谱图中被测得，碎片离子的实验分子组成指纹在二级质谱图中被测得。

16、进一步的，理论分子组成指纹通过以下步骤生成：

17、根据所研究体系的理论分子库计算每一个分子的分子式；

18、参照标准元素列表，根据分子式中元素的种类和数量计算相应的分子组成指纹。

19、进一步的，步骤s3和s5中的匹配是指实验分子组成指纹中的每一个同位素峰的m/z值和相对峰强度数值与对应的理论值的一一比较。

20、进一步的，步骤s3和s5中的匹配的标准由同位素峰强度截止值、同位素峰质荷比最大允许误差和同位素峰强度最大允许误差进行控制。

21、进一步的，步骤s9中的去重按照多肽骨架氨基酸序列和修饰、糖基化位点以及n-连接糖序列结构的标准。

22、本发明的有益效果是：

23、本发明的鉴定和验证方法在完整n-糖肽、单糖序列和单糖三个分子水平上基于质谱分子组成和结构指纹来对唾液酸进行鉴定和确认，包括1)在完整n-糖肽水平上，基于前体离子的同位素轮廓在一级质谱中对包含唾液酸完整n-糖肽的单糖组成进行鉴定；2)在单糖序列分子水平上，基于二级质谱中的碎片离子和靶向-诱饵库搜索对序列结构进行谱图水平上的假阳性控制和鉴定，以及基于序列结构诊断碎片离子的序列结构的确认；3)在单糖分子水平上，基于二级质谱中唾液酸的特征氧鎓离子的确认。经过上述3个分子水平上的鉴定和验证，最大限度地实现了基于质谱的蛋白质唾液酸的准确分析。

24、本发明的方法基于分子组成和结构指纹碎片离子的靶向筛选来实现有效串级质谱的选择性搜索，通过在串级质谱全面解析和假阳性控制前的唾液酸分子组成和结构指纹搜索和过滤，节省了在实验中未观察到对应的分子组成和结构指纹的含唾液酸候选分子的搜索，大大缩短了搜索时间，大大提高了生物信息学鉴定通量，适用于大队列样本质谱分析的基于分子组成和结构指纹的高准确度定性鉴定和定量分析。

25、本发明的方法基于唾液酸在单糖、单糖序列以及糖蛋白质组等三个分子水平上的结构指纹的靶向筛选实现含唾液酸完整n-糖肽的选择性搜索，从而节省现有“先搜索-后筛选”流程中用在无效单糖组成上的搜索时间，大大提高了含唾液酸完整n-糖肽解析的准确度和效率。

技术特征：

1.一种蛋白质唾液酸的鉴定和验证方法，其特征在于，包括如下步骤：

2.根据权利要求1所述的一种蛋白质唾液酸的鉴定和验证方法，其特征在于，所述待解析生物样本为含有唾液酸化糖蛋白的样本。

3.根据权利要求1所述的一种蛋白质唾液酸的鉴定和验证方法，其特征在于，步骤s2中，在进行电喷雾电离和质谱分析之前，先对完整n-糖肽样本进行液相分离。

4.根据权利要求1所述的一种蛋白质唾液酸的鉴定和验证方法，其特征在于，前体离子的实验分子组成指纹在一级质谱图中被测得，碎片离子的实验分子组成指纹在二级质谱图中被测得。

5.根据权利要求1所述的一种蛋白质唾液酸的鉴定和验证方法，其特征在于，理论分子组成指纹通过以下步骤生成：

6.根据权利要求1所述的一种蛋白质唾液酸的鉴定和验证方法，其特征在于，步骤s3和s5中的匹配是指实验分子组成指纹中的每一个同位素峰的m/z值和相对峰强度数值与对应的理论值的一一比较。

7.根据权利要求1所述的一种蛋白质唾液酸的鉴定和验证方法，其特征在于，步骤s3和s5中的匹配的标准由同位素峰强度截止值、同位素峰质荷比最大允许误差和同位素峰强度最大允许误差进行控制。

8.根据权利要求1所述的一种蛋白质唾液酸的鉴定和验证方法，其特征在于，步骤s9中的去重按照多肽骨架氨基酸序列和修饰、糖基化位点以及n-连接糖序列结构的标准。

技术总结
本发明公开了一种蛋白质唾液酸的鉴定和验证方法，包括如下步骤：制备完整N‑糖肽样本；完整N‑糖肽样本经电喷雾电离后得到前体离子，前体离子经气相解离得到碎片离子，对前体离子和碎片离子进行质谱分析；基于同位素轮廓指纹比对的含唾液酸候选单糖组成的鉴定；基于同位素轮廓比对的唾液酸氧鎓离子的鉴定及对候选单糖组成的筛选；基于同位素轮廓指纹比对的含唾液酸序列结构诊断碎片离子的鉴定及对候选单糖组成的进一步筛选；基于靶向‑诱饵库搜索的完整N‑糖肽鉴定的假阳性控制；获得含唾液酸完整N‑糖肽IDs。该方法能够节省现有“先搜索‑后筛选”流程中用在无效单糖组成上的搜索时间，大大提高了含唾液酸完整N‑糖肽解析的准确度和效率。

技术研发人员：黄才岭
受保护的技术使用者：汉诺生物科技（苏州）有限公司
技术研发日：
技术公布日：2024/1/11