一种磷酸特地唑胺中间体有关物质的检测方法与流程

1.本发明属于药物分析领域，具体涉及一种磷酸特地唑胺中间体有关物质的检测方法。


背景技术：

2.磷酸特地唑胺是由cubist制药公司研发的一种新型噁唑烷酮类抗菌素，2014年由fda批准上市，临床上用于治疗急性细菌性皮肤和皮肤结构感染。磷酸特地唑胺是一种前药，在体内可被磷酸酶迅速转化为具有生物活性的特地唑胺，从而抑制蛋白质的合成。其作用机制不同于其他抗菌素，不会与其他抗菌素发生交叉耐药现象。临床上主要用于治疗，金黄色葡萄球菌(包括耐甲氧西林菌株、甲氧西林敏感菌株)和各种链球菌属和粪肠球菌等革兰氏阳性细菌引起的急性细菌性皮肤和皮肤结构感染。
3.磷酸特地唑胺的化学名称为(r)-3-(4-(2-(2-甲基四唑-5-基)吡啶-5-基)-3-氟苯基)-5-羟甲基噁唑烷-2-酮磷酸酯，分子式为c
17h16
fn6o6p，结构式如下：化学名称为2-(2-甲基-2h-四唑-5-基)-5-(4,4,5,5-四甲基-1,3,2-二噁硼烷-2-基)吡啶的物质是合成磷酸特地唑胺原料药的关键中间体，为确保磷酸特地唑胺api的质量，需要控制中间体2-(2-甲基-2h-四唑-5-基)-5-(4,4,5,5-四甲基-1,3,2-二噁硼烷-2-基)吡啶中杂质的含量，以免其含有的杂质过大，参与下步反应而形成副产物，造成磷酸特地唑胺api有关物质超标。
4.磷酸特地唑胺中间体2-(2-甲基-2h-四唑-5-基)-5-(4,4,5,5-四甲基-1,3,2-二噁硼烷-2-基)吡啶的化学结构式如下：解析该磷酸特地唑胺中间体的化学结构和其合成工艺发现：化学名称为5-溴-2-(2-甲基-2h-四唑-5-基) 吡啶的物质是磷酸特地唑胺中间体的主要工艺杂质（简称杂质e），工艺中很可能会残留该杂质e，开发该杂质e的分析检测方法，并进行定性定量分析，可严格控制磷酸特地唑胺中间体的质量品质，从而保证产品磷酸特地唑胺api的质量符合要求。
5.。


技术实现要素：

6.为了有效控制磷酸特地唑胺的质量品质，本发明提供了一种2-(2-甲基-2h-四唑-5-基)-5-(4,4,5,5-四甲基-1,3,2-二噁硼烷-2-基)吡啶组合物，它含有质量比不低于99.7%的2-(2-甲基-2h-四唑-5-基)-5-(4,4,5,5-四甲基-1,3,2-二噁硼烷-2-基)吡啶、不高于0.3%的5-溴-2-(2-甲基-2h-四唑-5-基) 吡啶。
7.进一步地，所述5-溴-2-(2-甲基-2h-四唑-5-基) 吡啶含量不高于0.1%。
8.本发明还提供了一种磷酸特地唑胺的制备工艺，它是由前述的2-(2-甲基-2h-四唑-5-基)-5-(4,4,5,5-四甲基-1,3,2-二噁硼烷-2-基)吡啶组合物作为中间体制备而成。
9.本发明还提供了一种磷酸特地唑胺中间体有关物质的检测方法，它是采用高效液相色谱法检测，具体步骤如下：a、供试品溶液制备：取待测磷酸特地唑胺中间体，加乙腈水溶液溶解，即得；b、系统适用性溶液的制备：取有关物质对照品，加乙腈水溶液溶解，得有关物质溶液；取磷酸特地唑胺中间体对照品，加有关物质溶液溶解，再加乙腈水溶液混匀，即得；c、分别吸取供试品溶液和系统适用性溶液注入色谱仪，色谱条件如下：色谱柱：以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂；流动相：以0.02~0.08%无机酸水溶液为流动相a，以乙腈为流动相b；梯度洗脱程序为：时间/min流动相b/%流动相a/%01090157525207525211090331090
10.进一步地，步骤a）所述待测磷酸特地唑胺中间体与乙腈水溶液的质量体积比为0.5~2.5mg：1ml。
11.更进一步地，所述乙腈水溶液中乙腈与水的体积比为60：40。
12.进一步地，步骤b）所述系统适用性溶液每1ml含有关物质0.01~0.1mg，磷酸特地唑胺中间体0.5~1.5mg。
13.更进一步地，所述磷酸特地唑胺中间体为2-(2-甲基-2h-四唑-5-基)-5-(4,4,5,5-四甲基-1,3,2-二噁硼烷-2-基)吡啶；所述有关物质为5-溴-2-(2-甲基-2h-四唑-5-基) 吡啶。
14.进一步地，所述色谱柱为agilent 5 tc-c18(2)，规格 4.6
×
250mm，5μm；所述流动相a为0.05%，v/v的高氯酸水溶液。
15.进一步地，步骤c）所述检测波长为254nm，进样量10ul，流速为0.5 ~1.5ml/min；柱温为30~40℃，优选：流速为1.0ml/min，柱温为30℃。
16.进一步地，所述供试品溶液的色谱图中呈现与系统适用性溶液色谱图中有关物质色谱峰保留时间相对应的色谱峰，即供试品中含有相应有关物质。
17.本发明还提供了一种磷酸特地唑胺中间体有关物质的含量测定方法，具体操作步骤如下：1）按前述方法检测；
2）计算有关物质含量，计算公式如图9，图9中，x
ⅰ
%：供试品中有关物质的含量，a
ⅰ
：供试品溶液中有关物质峰面积，a：供试品溶液中所有峰面积之和，f:有关物质的校正因子；进一步地，所述有关物质为5-溴-2-(2-甲基-2h-四唑-5-基) 吡啶，其校正因子为 0.57。
18.本发明磷酸特地唑胺中间体有关物质的检测方法，通过特定的溶剂和色谱条件，可以将磷酸特地唑胺中间体与有关物质5-溴-2-(2-甲基-2h-四唑-5-基) 吡啶有效分离，用于检测磷酸特地唑胺中间体中的该杂质，准确测量磷酸特地唑胺中间体药物中工艺杂质5-溴-2-(2-甲基-2h-四唑-5-基) 吡啶的含量，测定结果稳定可靠，专属性强。
19.经方法学验证表明，本发明符合《中国药典》2020年版对分析方法学的要求。本发明检测方法可有效监控磷酸特地唑胺中间体的合成过程，用于磷酸特地唑胺中间体的质量检测，保证其质量，进而保证药品磷酸特地唑胺的质量安全，应用前景广阔。
20.显然，根据本发明的上述内容，按照本领域的普通技术知识和惯用手段，在不脱离本发明上述基本技术思想前提下，还可以做出其它多种形式的修改、替换或变更。
21.以下通过实施例形式的具体实施方式，对本发明的上述内容再作进一步的详细说明。但不应将此理解为本发明上述主题的范围仅限于以下的实例。凡基于本发明上述内容所实现的技术均属于本发明的范围。
附图说明
22.图1磷酸特地唑胺中间体2-(2-甲基-2h-四唑-5-基)-5-(4,4,5,5-四甲基-1,3,2-二噁硼烷-2-基)吡啶对照品hnmr图谱；图2 磷酸特地唑胺中间体2-(2-甲基-2h-四唑-5-基)-5-(4,4,5,5-四甲基-1,3,2-二噁硼烷-2-基)吡啶对照品 ms图谱；图3 磷酸特地唑胺中间体2-(2-甲基-2h-四唑-5-基)-5-(4,4,5,5-四甲基-1,3,2-二噁硼烷-2-基)吡啶对照品hplc纯度图谱；图4磷酸特地唑胺中间体系统适用性溶液hplc图；图5实施例1供试品溶液hplc图；图6实施例2供试品溶液hplc图；图7空白溶液hplc图；图8杂质e定位溶液hplc图 ；图9 有关物质含量计算公式的图；图10系统适用性评价结果的图；图11专属性实验结果的图；图12杂质e的定量限和检测限测试结果的图；图13杂质e的线性与范围测试结果的图；图14磷酸特地唑胺中间体线性与范围测试结果的图；图15有关物质校正因子的图；图16重复性测试结果的图；图17中间精密度的图；图18杂质e回收率的图。
具体实施方式
23.（1）主要材料磷酸特地唑胺中间体样品：自制，批号220401，220402；磷酸特地唑胺中间体对照品：自制，批号210101（磷酸特地唑胺中间体2-(2-甲基-2h-四唑-5-基)-5-(4,4,5,5-四甲基-1,3,2-二噁硼烷-2-基)吡啶对照品hnmr图谱如图1所示，ms图谱如图2所示，hplc纯度图谱如图3所示）。
24.杂质e对照品：黑龙江豪运药业有限公司，批号210501。杂质e对照品为5-溴-2-(2-甲基-2h-四唑-5-基) 吡啶。
25.(2) 主要仪器高效液相色谱仪：岛津lc-20at；色谱柱：agilent 5 tc-c18(2)，规格4.6
×
250mm，5μm。
26.实施例1、磷酸特地唑胺中间体样品杂质e的测定(1) 供试品溶液的制备：精密称取磷酸特地唑胺中间体样品（批号220401）置于容量瓶中，加体积比60：40的乙腈和水的混合溶液溶解，配制成1.0mg/ml的磷酸特地唑胺中间体供试品溶液。
27.(2) 系统适用性溶液的制备：精密称取杂质e对照品，加体积比60：40的乙腈和水的混合溶液溶解，配制成浓度为1.0mg/ml的溶液，作为杂质e储备液。精密称取磷酸特地唑胺中间体对照品25mg于25ml容量瓶中，精密加入杂质e储备液0.25ml，以体积比60：40的乙腈和水的混合溶液定容，即得系统适用性溶液。
28.(3) 色谱条件：色谱柱：agilent 5 tc-c18(2)，规格 4.6
×
250mm，5 μm；流动相：流动相a：0.05%高氯酸水溶液；流动相b：乙腈；检测波长：254nm；柱温箱：30℃；色谱柱流量：1ml/min，进样量10μl；梯度洗脱条件：时间（min）流动相b（%）流动相a（%）01090157525207525211090331090(4) 分别精密吸取供试品溶液和系统适用性溶液10 μl注入色谱仪，记录色谱图，以加校正因子的面积归一化法按图9中的公式计算供试品溶液中杂质e含量；a
ⅰ
：供试品溶液中杂质e峰面积值，a：供试品溶液中所有峰面积之和值，f：杂质e的校正因子为0.57。
29.x
ⅰ
%=0.0%，即批号220401的磷酸特地唑胺中间体样品中，杂质e的含量为0.0%。该供试品溶液的hplc色谱图如图5所示。
30.实施例2、磷酸特地唑胺中间体样品杂质e的测定(1) 供试品溶液的制备：精密称取磷酸特地唑胺中间体样品（批号220402）置于容量瓶中，加体积比60：40的乙腈和水的混合溶液溶解，配制成1.0mg/ml的磷酸特地唑胺中间
体供试品溶液。
31.(2) 系统适用性溶液的制备：精密称取杂质e对照品，加体积比60：40的乙腈和水的混合溶液溶解，配制成浓度为1.0mg/ml的溶液，作为杂质e储备液。精密称取磷酸特地唑胺中间体对照品25mg于25ml容量瓶中，精密加入杂质e储备液0.25ml，以体积比60：40的乙腈和水的混合溶液定容，即得系统适用性溶液。
32.(3) 色谱条件：色谱柱：agilent 5 tc-c18(2)，规格 4.6
×
250mm，5 μm；流动相：流动相a：0.05%高氯酸水溶液；流动相b：乙腈；检测波长：254nm；柱温箱：30℃；色谱柱流量：1ml/min，进样量10μl；梯度洗脱条件：时间（min）流动相b（%）流动相a（%）01090157525207525211090331090(4) 分别精密吸取供试品溶液和系统适用性溶液10 μl注入色谱仪，记录色谱图，以加校正因子的面积归一化法按图9中公式计算供试品溶液中杂质e含量；a
ⅰ
：供试品溶液中杂质e峰面积值，a：供试品溶液中所有峰面积之和值，f：杂质e的校正因子为0.57。
33.x
ⅰ
%=0.05%，即批号220402的磷酸特地唑胺中间体样品中，杂质e的含量为0.05%。该供试品溶液的hplc图如图6所示。
[0034] 以下通过试验例进一步说明本发明的有益效果：试验例1、系统适用性评价仪器及色谱条件：岛津lc-20at；色谱柱：agilent 5 tc-c18(2)，规格为4.6
×
250mm，5μm；流速：1.0ml/min；色谱柱温度：30℃；进样量10μl；检测器波长：254nm；流动相a：0.05%高氯酸水溶液，流动相b：乙腈；梯度洗脱条件：时间（min）流动相b（%）流动相a（%）01090157525207525211090331090溶液配制：(1) 空白溶液（下述稀释液）为：将乙腈和水按照体积比60:40混合，得稀释液；(2) 杂质e储备液：精密称取杂质e对照品25mg于25ml容量瓶中，加体积比60：40的乙腈和水的混合溶液溶解并稀释至刻度，摇匀，得杂质e储备液，其中杂质e对照品的浓度为1.0mg/ml；杂质e对照品为5-溴-2-(2-甲基-2h-四唑-5-基) 吡啶对照品；(3) 系统适用性溶液：精密称取磷酸特地唑胺中间体对照品25mg于25ml容量瓶
中，精密加入杂质e储备液0.25ml，再加稀释液稀释至刻度，得系统适用性溶液（系统适用性溶液中磷酸特地唑胺中间体对照品浓度为1.0mg/ml，杂质e对照品浓度为10μg/ml）；(4) 杂质e定位溶液：精密移取杂质储备液1.0ml于10ml容量瓶，加稀释液溶解并稀释至刻度，即得杂质e定位溶液，其中杂质e对照品的浓度为100μg/ml；(5) 供试品溶液：精密称取磷酸特地唑胺中间体样品（批号220401）25mg于25ml容量瓶中，加稀释液溶解并稀释至刻度，即得供试品溶液。
[0035]
检测：按上述色谱条件分别进样空白溶液、杂质e定位溶液、系统适用性溶液、供试品溶液，记录色谱过程，系统适用性溶液的hplc图如图4所示，图7为空白溶液的hplc图；图8为杂质e定位溶液的hplc图；供试品溶液与实施例1中供试品溶液相同，其色谱图如图5所示，分离度结果见图10。
[0036]
实验结果说明：空白无干扰，系统适用性溶液分离度为10.91，分离度远大于2.0，符合中国药典2020年版的要求。该方法能够很好的分离磷酸特地唑胺中间体和其杂质e。
[0037]
试验例2、专属性实验仪器及色谱条件和溶液配制方法均同试验例1。
[0038]
检测：方法专属性考察峰鉴别和选择性，按上述色谱条件分别进样空白溶液，杂质e定位溶液，记录色谱图，结果见图11。
[0039]
实验结果说明：该检测方法无其它杂质干扰，可用于本发明杂质e 5-溴-2-(2-甲基-2h-四唑-5-基) 吡啶峰鉴别。
[0040]
试验例3、检测限和定量限测试仪器及色谱条件和溶液配制方法均同试验例1。
[0041]
检测：检测限（lod）和定量限（loq）根据信噪比来确定。把已知浓度的杂质e储备液稀释到低浓度进样，检测信噪比s/n≥10确定为定量限，s/n=2～4确定为检测限。测试结果见图12。
[0042]
实验结果说明：杂质e的定量限和检测限远小于0.1%，满足国际药典通用规定的要求（大于0.1%的杂质应该定量），可用于磷酸特地唑胺中间体中对该杂质的定性和定量分析。
[0043]
试验例4、线性和范围测试仪器及色谱条件和溶液配制方法均同试验例1。
[0044]
检测：对于杂质e，在loq浓度至不低于150%指标浓度范围内取6个点进行研究，线性关系以测得的响应信号(峰面积)对被分析物（即杂质e对照品）浓度的函数作图，用最小二乘法进行线性回归，至少报告相关系数r2来证实良好的线性关系，要求该线性回归系数r2应不小于0.990。
[0045]
对于主成分磷酸特地唑胺中间体的线性和范围，结果图13~15。
[0046]
实验结果说明：杂质e在0.1202μg/ml～2.0134μg/ml范围内线性良好，测得杂质e校正因子为0.57，在0.2~5.0的范围内（由于校正因子不在0.9~1.1的范围内，需加校正因子进行校正），因此可用加校正因子的面积归一化法计算杂质e的含量。
[0047]
试验例5、精密度测试仪器及条件和溶液配制方法均同试验例1。
[0048]
检测：在磷酸特地唑胺中间体供试品中加入0.1%的杂质e的加标供试品溶液作为
测试溶液，平行配制6份，按照上述条件依次进样，重复性结果见图16。
[0049]
中间精密度采用相同操作方法，由不同人员在不同仪器上进行，结果见图17。
[0050]
实验结果说明：杂质e重复性和中间精密度rsd值小于2.0%，符合国际药典及中国药典的检测要求。
[0051]
试验例6、准确度测试仪器及条件和溶液配制方法均同试验例1。
[0052]
检测：准确度是通过在磷酸特地唑胺中间体供试品中加入杂质e限度0.1%的50％，100％，150％三个不同浓度杂质e，测定杂质e的回收率所得。已知杂质e的准确度是加入已知量的杂质e，再测定加样样品中已知杂质e的含量和理论值之间的比值(回收率)，以百分率％表达。结果见图18。
[0053]
实验结果说明：杂质e的回收率在100.77%～106.55%之间，平均回收率为：103.92%，准确度良好，符合国际药典和中国药典的要求。
[0054] 试验例1~6的研究结果表明，本发明一种测定磷酸特地唑胺中间体工艺杂质5-溴-2-(2-甲基-2h-四唑-5-基) 吡啶的方法具有很好的专属性，精密度良好，准确度高和灵敏度高，符合《中国药典》2020年版对分析方法学的要求，适用于磷酸特地唑胺中间体合成中对工艺杂质5-溴-2-(2-甲基-2h-四唑-5-基) 吡啶的质量控制。通过本发明方法对磷酸特地唑胺中间体的质量分析汇总，为确保以磷酸特地唑胺中间体为原料制备的磷酸特地唑胺api的质量，磷酸特地唑胺中间体中杂质e的含量应控制在0.1%。
[0055] 综上，本发明磷酸特地唑胺中间体杂质e的检测方法可以将磷酸特地唑胺中间体与其杂质e（即5-溴-2-(2-甲基-2h-四唑-5-基) 吡啶）有效分离，可以用于检测磷酸特地唑胺中间体中的该杂质，准确测量磷酸特地唑胺中间体药物中工艺杂质5-溴-2-(2-甲基-2h-四唑-5-基) 吡啶的含量，测定结果稳定可靠，专属性强。方法学验证结果表明，本发明符合《中国药典》2020年版对分析方法学的要求。本发明检测方法可有效监控磷酸特地唑胺中间体的合成过程，用于磷酸特地唑胺中间体的质量检测，保证其质量。