一种食品中类胡萝卜素的快速检测方法与流程

本发明涉及食品中天然色素成分检测领域，尤其涉及一种食品中类胡萝卜素的快速检测方法。

背景技术：

1、类胡萝卜素，是天然色素的重要组成部分，由一系列共轭异戊二烯单元组成，极易发生氧化和其他化学修饰，最常见的修饰基团有羟基、甲氧基、羰基、羧基等。迄今为止，已有750多种类胡萝卜素被发现报道，按照化学结构可将它们分为两大类，第一类是游离类胡萝卜素，包括不含氧的α-胡萝卜素和β-胡萝卜素，以及含氧的叶黄素、虾青素等，第二类是酯化类胡萝卜素，根据脂肪酸链键合的数量，可划分为类胡萝卜素单酯和类胡萝卜素双酯。这些光敏性的类胡萝卜素除了作为天然着色剂，提高食品感官品质外，在维持人体健康方面的价值也逐渐被报道，包括提高人体免疫力，改善视力等。天然色素取代人工合成色素将是食品行业健康发展的必然趋势。出于监管需要，有必要对食品中添加的类胡萝卜素进行检测分析，然而，食品中类胡萝卜素所具有的极端疏水性和高度复杂性使得该类化合物的快速提取、纯化和分析研究面临巨大挑战。

2、传统检测类胡萝卜素的前处理技术主要是直接溶剂萃取。该技术多采用单一有机试剂作为提取溶剂，如丙酮、甲醇或乙酸乙酯等，存在选择性弊端，尤其对小分子游离类胡萝卜素，和低极性类胡萝卜素酯不能同时兼容，且没有针对提取液基质属性进行净化处理，仅仅适用于固定食品基质中某一类胡萝卜素检测的分析方法，样品处理通量不高。

3、前期，本课题组针对水产生物的基质属性，建立了一种水产品中类胡萝卜素的高通量检测方法，实现了水生品中类胡萝卜素的检测分析，前处理采用分步提取，分级净化的实验思路，同时结合了固相萃取和基体分散两种净化技术，但是，该前处理方法适用于基质简单干净的水产生物，却不适用于高蛋白高油脂的食品基质，将该方法用于食品基质，特别是高油脂食品基质中，对类胡萝卜素进行提取、净化时，发现由于食品基质中含有丰富的添加剂成分，采用hlb净化时，由于淋洗过程的缺失，导致游离类胡萝卜素的净化效果差；另外方法中采用中性氧化铝粉对提取的酯化类胡萝卜素中的油脂成分进行吸附去除，对于油脂含量较高的食品基质适用性差，导致回收率结果整体偏低，且分步提取、分级净化导致整个实验过程比较复杂，耗时较长。因此，需要寻求一种更为全面、高效的前处理方法对食品中类胡萝卜素种类进行快速检测分析。

技术实现思路

1、本发明的目的是为了弥补现有食品中类胡萝卜素检测方法所存在的选择性弊端、检出种类少、检测效率低、回收率低等缺点，提供了一种适用于复杂食品基质中类胡萝卜素的快速检测方法。

2、考虑到类胡萝卜素覆盖种类众多，不同类别之间极性差异较大；且食品具有的高蛋白质、高脂肪的基质属性，进而产生强烈的基质效应，导致检测结果严重偏离。因此，本发明采用改进的bligh-dyer法来提取食品基质中的类胡萝卜素。

3、bligh-dyer法是脂质分析的传统方法，它采用氯仿-甲醇-水作为提取液，该提取液极性范围覆盖广，在一定比例下(2:2:1.8,v/v/v)可主动分层为水相层和有机相层。酯化类胡萝卜素在结构上与脂类相似，都含有一种或两种脂肪酸，类胡萝卜素也被称为类脂色素。因此，根据提取溶剂的pka值及目标化合物的极性范围，本发明采用氯仿-甲醇-水作为提取溶剂，游离类胡萝卜素主要分布在水相层中，部分低级性游离类胡萝卜素和酯化类胡萝卜素则主要分布在有机相层中，通过同步收集水相和有机相，可同时保留游离类胡萝卜素和酯化类胡萝卜素，进一步优化净化步骤，即可实现食品中类胡萝卜素的快速检测分析。

4、本发明采用的技术方案为：

5、一种食品中类胡萝卜素的检测方法，所述类胡萝卜素包括23种类胡萝卜素，为番茄红素、α-胡萝卜素、ε-胡萝卜素、β-胡萝卜素、γ-胡萝卜素、δ-胡萝卜素、α-隐黄素、β-隐黄素、叶黄素、玉米黄素、环氧玉米黄素、紫黄素、新黄素、岩藻黄酮醇、岩藻黄素、硅藻黄素、硅甲藻黄素、角黄素、虾青素、亚油酸虾青素单酯、二十二碳六烯酸虾青素单酯、双硬脂酸虾青素酯、双棕榈酸虾青素酯中的一种或多种，所述方法包括以下步骤：

6、a.前处理：

7、(a1)称取2g待检测食品样品，用7.5ml含0.1wt％2,6-二叔丁基对甲酚的氯仿-甲醇-水溶液重复提取3次，离心，合并上层提取液；

8、所述氯仿-甲醇-水溶液中，氯仿、甲醇、水的体积比为1:2:0.8；

9、提取时一般震荡5～10min，超声提取5～10min；

10、离心一般在12000r/min的转速下离心5～10min；

11、2,6-二叔丁基对甲酚(bht)是一种抗氧化剂，可用于防止类胡萝卜素的氧化；

12、(a2)取步骤(a1)得到的上层提取液，并依次向其中加入6.0ml水、6.0ml氯仿，离心后自动分层，得到上层水相及下层有机相；

13、所述离心一般在12000r/min的转速下离心5～10min；

14、(a3)取步骤(a2)得到的水相，上样至hlb柱，然后用6.0ml甲醇-水溶液进行淋洗；

15、所述甲醇-水溶液中，甲醇与水的体积比为3:2；

16、(a4)将步骤(a2)的有机相和6.0ml氯仿，依次作为hlb净化柱的洗脱剂进行洗脱，收集流出的洗脱液；

17、(a5)取步骤(a4)得到的洗脱液，浓缩干燥，然后用含0.1wt％2,6-二叔丁基对甲酚的甲醇溶液定容至2.0ml，滤膜过滤作为供试品溶液；

18、所述浓缩干燥一般是用氮吹浓缩至体积不再变化；

19、b.高效液相色谱-质谱检测

20、将步骤(a5)得到的供试品溶液用高效液相色谱-四极杆静电场轨道阱高分辨质谱仪检测，得到供试品溶液的高效液相色谱-质谱图，其中，仪器条件如下：

21、高效液相色谱条件：

22、色谱柱syncronisc18柱(2.1mm×150mm,粒径1.7μm)；

23、流动相a：含有10mm甲酸铵的乙腈、水体积比9:1的溶液；

24、流动相b：乙腈、异丙醇体积比7:3的溶液，流速:0.3ml/min，进样量:5.0μl，分流比1:4，梯度洗脱，洗脱程序优选如下表1:

25、表1：梯度洗脱程序

26、

27、质谱参数：质谱在正离子转换模式下进行全扫描测定，质量范围：m/z100～1200，分辨率70000，自动增益控制目标值5*e5；正离子模式3800v，离子传输管温度为300℃，去溶剂气氮气流速：35l/h，辅助气氮气流速：15l/h，气化室温度350℃；在样品运行前对仪器进行正离子校正；二级采用自动触发模式，分辨率35000，自动增益控制目标值2*e5，归一化碰撞能依次为30％、40％和60％，保留时间根据目标物保留时间±1.0min；

28、c定量分析

29、采用外标法定量，检测得到供试品溶液中的类胡萝卜素含量，并换算得到待检测食品样品中的23种类胡萝卜素含量。

30、进一步，所述步骤c定量分析包括以下步骤：

31、(c1)制作标准品的标准曲线：

32、取番茄红素、α-胡萝卜素、ε-胡萝卜素、β-胡萝卜素、γ-胡萝卜素、δ-胡萝卜素、α-隐黄素、β-隐黄素、叶黄素、玉米黄素、环氧玉米黄素、紫黄素、新黄素、岩藻黄酮醇、岩藻黄素、硅藻黄素、硅甲藻黄素、角黄素、虾青素、亚油酸虾青素单酯、二十二碳六烯酸虾青素单酯、双硬脂酸虾青素酯、双棕榈酸虾青素酯的标准品，配制成不同浓度的混合标准工作液，按照步骤b相同条件进行高效液相色谱-质谱检测，得到标准工作液的高效液相色谱-质谱图，分别对各个标准品，按照其浓度和峰面积，绘制标准曲线，得到上述标准品的标准曲线；

33、(c2)根据步骤b得到的供试品溶液的高效液相色谱-质谱图、对应的标准品的标准曲线，计算供试品溶液中各待测成分的浓度，以公式(1)计算待检测食品样品中类胡萝卜素的含量：

34、x＝c*v/m*1000

35、式中：

36、x－试样中待测物含量，单位为mg/kg；

37、c－供试品溶液中待测物浓度，根据标准曲线计算得到，单位为μg/l

38、v—定容体积，单位为ml；

39、m－待检测食品样品质量，单位为g。

40、进一步地，步骤(a1)中的待检测食品样品可以为各类固态、液态食品，一般为加工后可直接食用的食品，含有各类食品添加剂，包括淀粉类加工食品，油脂类加工食品，糖果和巧克力类食品、酒类、饮料、调味料等。本发明选择火腿肠、果酱和曲奇饼干作为本发明方法学验证的代表性食物基质。这些食品涵盖了不同的基质属性，包括固体、液体和高油脂食品，添加色素丰富，是常用食品中前处理技术的验证基质。

41、进一步地，所述步骤(c1)中的不同浓度的混合标准工作液的浓度分别为0ng/ml、10ng/ml、20ng/ml、50ng/ml、100ng/ml和200ng/ml。

42、在提取步骤中，根据bligh-dyer法，选择氯仿-甲醇-水(1：2：0.8，v/v/v，0.1％bht)混合物作为提取溶剂，三种溶剂的极性覆盖范围广，完全满足类胡萝卜素类化合物的提取需求。其中，甲醇和水溶液很好的保证了游离胡萝卜素的提取效率，氯仿提取的部分则主要包括低极性的酯化胡萝卜素和部分游离类胡萝卜素。此外，水溶液的存在可以很好的防止乳化现象的发生，使分层界面更加清晰，bht可以很好的避免类胡萝卜素发生氧化反应。提取得到的提取液是有机相和水相的混合液，提取三次后加入水和氯仿，不添加任何盐类化合物的情况下，混合溶剂在固定比值下，即：氯仿-甲醇-水的比例(2:2:1.8,v/v/v)下，会自动分层为水相层-有机相层(bligh和dyer，1959)。这可以避免用盐溶液分层导致的污染仪器。中极性游离类胡萝卜素主要分布在水相，低极性游离和酯化类胡萝卜素主要分布在有机相。

43、本发明的净化步骤的原理在于，首先，步骤(a2)得到的上层水相上样到hlb柱后，游离类胡萝卜素保留在hlb柱上，经优化后的甲醇-水淋洗后，可有效去除亲水化合物的干扰，然后在洗脱时，洗脱剂分为两部分，依次作为hlb净化柱的洗脱剂进行洗脱，第一部分洗脱液是将步骤(a2)中，作为辅助提取剂的下层有机相，通过调整氯仿-甲醇-水的比例(2:2:1.8,v/v/v)使氯仿和部分甲醇从提取液中分离出来，得到的有机相层位于下层，它作为辅助提取剂，很好地保证了非极性类胡萝卜素酯的回收率。水相层上样后，位于下层的有机相作为洗脱剂逐级渗入，使偏极性的游离类胡萝卜素和非极性酯化类胡萝卜素依次从hlb净化柱上洗脱下来。第二部分的洗脱液是氯仿溶剂，通过优化氯仿的洗脱体积，在确保强疏水性类胡萝卜素双酯的完全洗脱的同时，尽可能的消除油脂类化合物的干扰。最后，采用高效液相色谱-四极杆静电场轨道阱高分辨质谱(hplc-q-orbitrap-hrms)进行数据分析，即可实现对食品中类胡萝卜素的快速分析检测。

44、本发明采用的高效液相色谱-四极杆静电场轨道阱高分辨质谱(hplc-q-orbitrap-hrms)技术与常规三重四级杆质谱的区别在于，它不需要已知待测化合物的特征离子碎片，而是直接采用高精度质量数(分辨率≥70000，m/z200)对待测样品进行定向和非定向的全扫描检测，需要增加目标化合物时，不需重复进样，重新分析已有的全扫描数据即可，特别适合多组分同时定性、定量分析。

45、本发明的有益效果在于：

46、1、本发明的类胡萝卜素测定低限为0.02～0.05mg/kg，标准曲线在10ng/ml～200ng/ml线性范围内良好(回归系数r2>0.99)；

47、2、前处理利用氯仿-甲醇-水作为提取溶剂，通过同步收集水相和有机相层，并利用亲水亲脂平衡柱进行净化，在有效消除亲水化合物和中性甘油三酯的干扰的同时，可满足理化性质差异很大的2大类类胡萝卜素的提取、净化需求，比现有技术简化了提取步骤，在提高检测效率的同时降低了昂贵的时间、试剂成本消耗；

48、3、本方法应用于食品中常见23种类胡萝卜素快速检测分析，回收率高达80.1–98.7％，具有较高的灵敏度和可靠性，检测到的类胡萝卜素回收率均优于已有检测方法。