一种应用天然低共熔溶剂超声提取黄芪红花药对有效成分的方法

本发明提供了一种应用天然低共熔溶剂超声提取黄芪红花药对有效成分的方法。

背景技术：

1、脑卒中是我国居民致死与致残的首位原因，严重影响患者的生命健康和生活质量。黄芪-红花药对是中医临床上的经典药对，在黄芪红花汤、补阳还五汤与脑心通胶囊中都有配伍应用，对缺血性脑血管病的疗效确切。黄芪是脑卒中治疗中药中使用频率最高的补气药，可充盈气血，行滞通痹，改善患者气血亏虚的症状；红花为经典的活血化瘀药，可以调经活血、止血止痛，两药在保护脑缺血损伤的诸多机制和途径上有许多相似之处，如都能抑制细胞凋亡与炎症反应、抗氧化、清除自由基以及调节信号通路等来发挥脑保护作用。

2、中药或天然药物中所含的有效成分是治疗疾病的物质基础，如何有效地提取其中的活性成分一直是研究的重点。常用中药提取溶剂虽然有着操作简单和成本低等优点，但多数溶剂也存在着毒性问题，很可能会对环境与药物产生影响。随着环境保护意识不断深入人心，人们对健康绿色的要求也越来越高。绿色提取概念也随之提出，低共熔溶剂(dess)是一种新型的绿色溶剂，由氢键受体(hba)和氢键供体(hbd)两类化合物组成，两者可能通过氢键作用促进混合体系形成并拥有良好的溶剂特性，有着无毒、低挥发性、高热稳定性等特点。天然低共熔溶剂(nature deep eutectic solvents,nadess)完全由天然产物组成，其中的hba常用胺类，hbd常用有机酸或碳水化合物。nadess对天然产物特别是水溶性较差的化合物以及大分子物质具有高溶解能力，在中药提取中有着较大的潜力。

技术实现思路

1、本发明提供了一种应用天然低共熔溶剂超声提取黄芪红花药对有效成分的方法。

2、一种应用天然低共熔溶剂超声提取黄芪红花药对有效成分的方法，该方法为：按比例精密称取黄芪和红花粉末，加入天然低共熔溶剂，超声提取；提取物离心后，取上清加超纯水稀释，过孔滤膜；用hplc对各提取物中9种有效成分进行定量；所述天然低共熔溶剂为bet-lac溶剂。

3、优选的，提取时间85-90min、温度65-75℃、bet-lac浓度70-80％、液料比48-52mg/ml。

4、优选的，提取时间90min、温度65℃、bet-lac浓度80％、液料比50mg/ml。

5、优选的，按3:1比例精密称取黄芪与红花粗粉。

6、优选的，天然低共熔溶剂的制备方法为：bet-lac和水分别按1:1摩尔比混合，用油浴锅加热并保持80℃直至形成澄清液体，加热期间保持磁力搅拌以保证熔化后的液体混合均匀。

7、本申请方法包括如下步骤：

8、(1)试品溶液的制备

9、按临床常用剂量比例精密称取黄芪和红花粉末，加入天然低共熔溶剂，超声提取；提取物离心后，取上清加超纯水稀释，过孔滤膜，得供试品溶液；

10、(2)对照品溶液的制备

11、精密称取毛蕊异黄酮、毛蕊异黄酮苷、芒柄花苷、羟基红花黄色素a、脱水红花黄色素b、美迪紫檀苷、紫丁香苷、山奈酚-3-o-芸香糖苷与红花红色素对照品，加甲醇分别配制成对照品溶液；精密吸取各对照品溶液，配制成混合对照品溶液；

12、(3)hplc-dad含量测定。

13、其中，

14、步骤(2)：精密称取毛蕊异黄酮、毛蕊异黄酮苷、芒柄花苷、羟基红花黄色素a、脱水红花黄色素b、美迪紫檀苷、紫丁香苷、山奈酚-3-o-芸香糖苷与红花红色素对照品适量，加甲醇分别配制成2.330、2.000、2.556、4.450、3.880、2.330、1.005、2.330、4.000mg/ml的对照品溶液。精密吸取各对照品溶液，配制成每1ml溶液含毛蕊异黄酮210μg，毛蕊异黄酮苷180μg，芒柄花苷230μg，羟基红花黄色素a400μg，脱水红花黄色素b 350μg，美迪紫檀苷210μg，紫丁香苷90μg，山奈酚-3-o-芸香糖苷210μg，红花红色素400μg的混合对照品溶液。

15、步骤(3)hplc-dad含量测定色谱条件为：

16、色谱柱：alltech alltima c18色谱柱(250mm×4.6mm，5μm)；保护柱：alltechalltima c18保护柱(12.5mm×4.6mm)；流速：1.0ml/min；柱温：30℃；流动相：乙腈(a)、0.01％三氟乙酸水溶液(b)；梯度洗脱程序：0-7min，10％-14％a；7-10min，14％-18％a；10-20min，18％-20％a；20-27min，20％-20％a；27-30min，20％-23％a；30-36min，23％-26％a；36-44min，26％-34％a；44-53min，34％-50％a；检测波长：403nm检测羟基红花黄色素a与脱水红花黄色素b，260nm检测毛蕊异黄酮、毛蕊异黄酮苷、芒柄花苷、山奈酚-3-o-芸香糖苷与紫丁香苷，210nm检测美迪紫檀苷，520nm检测红花红色素。

17、另外，本申请方法还提供了一种参数优化方法：采用遗传神经网络模型参数优化并预测最优提取条件和综合评分。

18、本专利以黄芪红花药对中9种有效成分(羟基红花黄色素a、脱水红花黄色b、紫丁香苷、毛蕊异黄酮苷、山奈酚-3-o-芸香糖苷、芒柄花苷、毛蕊异黄酮、美迪紫檀苷与红花红色素)的含量为评价指标，熵权法赋予权重，计算综合得分，运用响应面设计和遗传神经网络优化，得到了一种应用天然低共熔溶剂超声提取黄芪红花药对有效成分的方法。采用建立的uplc-ms/ms方法，对低共熔溶剂提取物中羟基红花黄色素a、紫丁香苷、毛蕊异黄酮苷、芒柄花苷和毛蕊异黄酮在大鼠体内的药代动力学研究结果显示，与水提取物相比较，低共熔提取显著提高了5种成分在大鼠体内的生物利用度(p<0.05)。

技术特征：

1.一种应用天然低共熔溶剂超声提取黄芪红花药对有效成分的方法，该方法为：按比例精密称取黄芪和红花粉末，加入天然低共熔溶剂，超声提取；提取物离心后，取上清加超纯水稀释，过孔滤膜；用hplc对各提取物中9种有效成分进行定量；所述天然低共熔溶剂为bet-lac溶剂。

2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：提取时间85-90min、温度65-75℃、bet-lac浓度70-80％、液料比48-52mg/ml。

3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：提取时间90min、温度65℃、bet-lac浓度80％、液料比50mg/ml。

4.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：按3:1比例精密称取黄芪与红花粗粉。

5.根据权利要求1或2所述的方法，其特征在于：天然低共熔溶剂的制备方法为：bet-lac和水分别按1:1摩尔比混合，用油浴锅加热并保持80℃直至形成澄清液体，加热期间保持磁力搅拌以保证熔化后的液体混合均匀。

6.根据权利要求1或2所述的方法，其特征在于：包括如下步骤：

7.根据权利要求6所述的方法，其特征在于：步骤(2)：精密称取毛蕊异黄酮、毛蕊异黄酮苷、芒柄花苷、羟基红花黄色素a、脱水红花黄色素b、美迪紫檀苷、紫丁香苷、山奈酚-3-o-芸香糖苷与红花红色素对照品适量，加甲醇分别配制成2.330、2.000、2.556、4.450、3.880、2.330、1.005、2.330、4.000mg/ml的对照品溶液。精密吸取各对照品溶液，配制成每1ml溶液含毛蕊异黄酮210μg，毛蕊异黄酮苷180μg，芒柄花苷230μg，羟基红花黄色素a400μg，脱水红花黄色素b 350μg，美迪紫檀苷210μg，紫丁香苷90μg，山奈酚-3-o-芸香糖苷210μg，红花红色素400μg的混合对照品溶液。

8.根据权利要求6所述的方法，其特征在于：步骤(3)hplc-dad含量测定色谱条件为：

9.权利要求1所述的方法的优化方法，其特征在于：采用遗传神经网络模型优化并预测最优提取条件和综合评分。

技术总结
本发明提供了一种应用天然低共熔溶剂超声提取黄芪红花药对有效成分的方法。本专利以黄芪红花药对中9种有效成分的含量为评价指标，熵权法赋予权重，计算综合得分，运用响应面设计和遗传神经网络优化，得到了一种应用天然低共熔溶剂超声提取黄芪红花药对有效成分的方法。采用建立的UPLC‑MS/MS方法，对低共熔溶剂提取物中羟基红花黄色素A、紫丁香苷、毛蕊异黄酮苷、芒柄花苷和毛蕊异黄酮在大鼠体内的药代动力学研究结果显示，与水提取物相比较，低共熔提取显著提高了5种成分在大鼠体内的生物利用度(P<0.05)。

技术研发人员：何昱,万海同,金伟峰,虞立,李畅,金磊
受保护的技术使用者：浙江中医药大学
技术研发日：
技术公布日：2024/1/13