一种BCG-PPD原液中三氯乙酸含量的检测方法及应用与流程

本发明涉及三氯乙酸含量的测定，特别涉及一种bcg-ppd原液中三氯乙酸含量的检测方法及应用。

背景技术：

1、结核病是由结核分枝杆菌引起的一种空气传播性传染病，结核分枝杆菌主要影响肺部，据统计肺结核约占全球总病例的80％，在新冠病毒大流行前，结核病是导致单一感染源死亡的主要原因，并且可以感染身体的其他组织，即肺外结核，包括肠道、脑膜、淋巴结、骨骼、关节、肾脏和皮肤等。从临床医学的角度来看，结核病疾病谱的动态范围是从非传染性的结核分枝杆菌潜伏感染到非常活跃的传染性结核病。

2、从流行病学上看，结核病仍然是世界上一个主要的全球公共卫生问题。由于新型冠状病毒的流行性，受诊断和报告的人数大幅下降，其人数从2019年的710万下降到2020年的580万，远远低于2020年约有1000万人患结核病的预期水平，中国占全球总病例数的8.5％，位于世界第二。基于此，全球各级国家tb死亡人数大幅度上升，2020年由结核病引起的全球死亡总人数为130万。

3、2020年who发布了《who关于结核病的更新指南：结核病的预防性治疗》，强调对结核病高风险人群进行结核病预防性治疗，是实现2035年终止结核病战略目标的关键手段之一。而对结核病高风险人群的首要任务就是需要有效可及的检测工具将这部分人群尽早发现出来。在结核病的诊断中，痰检、痰培养或病理性活检见抗酸杆菌可以确诊。但由于临床上痰检并不常用，阳性率低下，因此结核病诊断常依据临床表现、胸片、免疫组化、结核菌素试验(纯蛋白衍生物试验purified protein derivative，ppd)等进行综合判断。ppd皮试试验是诊断结核感染的重要参考指标。结核菌素皮肤试验是临床诊断和筛查结核病的一种常用方法。目前，国内常用的ppd试验有两种：(bcg-ppd和tb-ppd)。通过bcg-ppd和tb-ppd在临床上的对比分析，他们用于临床安全性和效价方面均具有良好的一致性。

4、《中国药典》2020版三部中规定，bcg-ppd原液的纯化方法为用三氯乙酸和饱和硫酸铵法分别沉淀蛋白质，或采用经批准的方法纯化。依据《中国药典》2020版(通则0861残留溶剂测定法)项下内容，三氯乙酸属于药品中常见残留溶剂的第四类溶剂，目前尚无其残留限度的明确规定，为保证原液中三氯乙酸残留量过高引起的不良反应，在bcg-ppd原液质控项中增加三氯乙酸含量检测，制定相应的限度，为制品的安全性提供保障。

技术实现思路

1、针对上述问题，本发明提出一种bcg-ppd原液中三氯乙酸含量的检测方法，所述方法包括：

2、根据标准三氯乙酸溶液确定所述标准三氯乙酸溶液浓度与其相对应吸光度值的直线回归方程；

3、在同一条件下确定bcg-ppd原液供试品的吸光度值；

4、根据所述bcg-ppd原液供试品的吸光度值与所述直线回归方程确定所述bcg-ppd原液中三氯乙酸含量。

5、进一步的，根据标准三氯乙酸溶液确定所述标准三氯乙酸溶液浓度与其相对应吸光度值的直线回归方程包括：

6、配制标准三氯乙酸溶液和氢氧化钾溶液；

7、将不同稀释度的所述标准三氯乙酸溶液分别与所述氢氧化钾溶液相混合得到混合液；

8、所述混合液需要水浴、冷却及离心取上清液等处理；

9、测定所述上清液在特定波长下不同标准三氯乙酸溶液浓度的吸光度值；

10、根据所述不同标准三氯乙酸溶液浓度与其相对应吸光度值确定直线回归方程。

11、进一步的，所述标准三氯乙酸溶液的浓度为80～120μg/ml；

12、所述氢氧化钾溶液的浓度为7～8mol/l。

13、进一步的，将不同稀释度的所述标准三氯乙酸溶液分别与所述氢氧化钾溶液相混合得到混合液包括：

14、将所述标准三氯乙酸溶液分别稀释特定倍数，分别取第一容积不同稀释浓度的所述标准三氯乙酸溶液加入第二容积的氢氧化钾溶液，并加水至第三容积；

15、在所述第三容积的溶液中分别加入第四容积的吡啶和第五容积的甲苯，摇匀得到混合液。

16、进一步的，所述特定倍数为所述标准三氯乙酸溶液分别稀释至其标准浓度的0.01倍、0.02倍、0.05倍、0.1倍、0.3倍、0.6倍。

17、进一步的，所述第一容积与所述第二容积的比值为1:2～1:3；

18、所述第一容积与所述第三容积的比值为1:4～1:5；

19、所述第一容积与所述第四容积的比值为1:4～1:6；

20、所述第一容积与所述第五容积的比值为1:0.2～1:1。

21、进一步的，所述混合液经过水浴、冷却及离心取上清液包括：

22、所述混合液在温度60～70℃水浴中反应40～60min，冷却至室温并取与所述第一容积比为1:3～1:5的有机层，并经4000～6000rpm离心5～15min后取出与所述有机层容积比为3:5～1:1的液体放入另一支试管，再加入与所述试管体积比例为6:1～4:1的水，混匀。

23、进一步的，所述特定波长为500～550nm。

24、进一步的，所述吸光度值的测量通过分光光度法测定。

25、本发明还提出一种上述检测方法测定bcg-ppd原液中三氯乙酸含量的应用。

26、本发明的bcg-ppd原液中三氯乙酸含量的检测方法及应用，该检测方法可以在2～3h内完成检测，本发明公开的检测精密度符合国家药典规定，实验操作简单便捷，并且在实验过程中无需昂贵仪器，具有很好的经济适用性。

27、本发明的其它特征和优点将在随后的说明书中阐述，并且，部分地从说明书中变得显而易见，或者通过实施本发明而了解。本发明的目的和其他优点可通过在说明书以及附图中所指出的结构来实现和获得。

技术特征：

1.一种bcg-ppd原液中三氯乙酸含量的检测方法，其特征在于，所述方法包括：

2.根据权利要求1所述的bcg-ppd原液中三氯乙酸含量的检测方法，其特征在于，根据标准三氯乙酸溶液确定所述标准三氯乙酸溶液浓度与其相对应吸光度值的直线回归方程包括：

3.根据权利要求2所述的bcg-ppd原液中三氯乙酸含量的检测方法，其特征在于，

4.根据权利要求2或3所述的bcg-ppd原液中三氯乙酸含量的检测方法，其特征在于，将不同稀释度的所述标准三氯乙酸溶液分别与所述氢氧化钾溶液相混合得到混合液包括：

5.根据权利要求4所述的bcg-ppd原液中三氯乙酸含量的检测方法，其特征在于，

6.根据权利要求4所述的bcg-ppd原液中三氯乙酸含量的检测方法，其特征在于，

7.根据权利要求4所述的bcg-ppd原液中三氯乙酸含量的检测方法，其特征在于，所述混合液需要水浴、冷却及离心取上清液处理，具体包括：

8.根据权利要求2所述的bcg-ppd原液中三氯乙酸含量的检测方法，其特征在于，所述特定波长为500～550nm。

9.根据权利要求1所述的bcg-ppd原液中三氯乙酸含量的检测方法，其特征在于，所述吸光度值的测量通过分光光度法测定。

10.一种权利要求1-9任一项所述的检测方法在测定bcg-ppd原液中三氯乙酸含量的应用。

技术总结
本发明提出一种BCG‑PPD(卡介菌纯蛋白衍生物，Purified Protein Derivative of BCG，BCG‑PPD)原液中三氯乙酸含量的检测方法及应用，所述方法包括：根据标准三氯乙酸溶液确定所述标准三氯乙酸溶液浓度与其相对应吸光度值的直线回归方程；在同一条件下确定BCG‑PPD原液供试品的吸光度值；根据所述BCG‑PPD原液供试品的吸光度值与所述直线回归方程确定所述BCG‑PPD原液中三氯乙酸含量。该检测方法可以在2～3h内完成检测，本发明公开的检测精密度符合国家药典规定，实验操作简单便捷，并且在实验过程中无需昂贵仪器，具有很好的经济适用性。

技术研发人员：卢荣江,胡仲皓,江秋虹,吴宇杰,朱克骏,赵爱华,王国治,陶立峰
受保护的技术使用者：安徽智飞龙科马生物制药有限公司
技术研发日：
技术公布日：2024/1/13