一种盐酸美法仑中细菌内毒素的检测方法与流程

本申请属于药物分析，尤其涉及一种盐酸美法仑中细菌内毒素的检测方法。

背景技术：

1、细菌内毒素是革兰氏阴性菌的细胞壁的产物，细菌在生活状态时不释放出来，只有当细菌死亡自溶或粘附在其它细胞时，才表现其毒性。当内毒素通过消化道进入人体时并不产生危害，但内毒素通过注射等方式进入血液时则会引起不同的疾病。因此，生物制品类、注射用药剂、化学药品类、放射性药物、抗生素类、疫苗类、透析液等制剂以及医疗器材类（如一次性注射器，植入性生物材料）必须经过细菌内毒素检测试验合格后才能使用。

2、目前细菌内毒素检查法包括凝胶法和光度测定法两种方法。前者利用鲎试剂与细菌内毒素产生凝集反应的原理来定性检测或半定量内毒素，后者包括浊度法和显色基质（比色）法，系分别利用鲎试剂与内毒素反应过程中的浊度变化及产生的凝固酶使特定底物释放出呈色团的多少来定量测定内毒素。其中，光度测定法由于依赖专业设备、操作复杂，普及率较低。

3、盐酸美法仑主要成分为4-[双（2–氯乙基）氨基]-l-苯丙氨酸盐酸盐，细菌内毒素在盐酸美法仑中的限值一般不得超过0.4eu/mg。然而针对一些药品品种，采用中国药典的细菌内毒素检查法（凝胶法）不能达到检测限要求。因此，需要开发一种具有更高检测精度的细菌内毒素检测方法以适应日益严格的药品安全监管要求。

技术实现思路

1、有鉴于此，本申请提供了一种盐酸美法仑中细菌内毒素的检测方法，能够有效降低盐酸美法仑中细菌内毒素凝胶检测法的检测限，且具有良好的稳定性和准确度。

2、本申请的具体技术方案如下：

3、本申请提供一种盐酸美法仑中细菌内毒素的检测方法，包括如下步骤：

4、配制不同浓度的细菌内毒素标准溶液，采用细菌内毒素标准溶液进行鲎试剂灵敏度复核试验，确定鲎试剂的标示灵敏度；

5、配制不同浓度的细菌内毒素对照品溶液，采用细菌内毒素标准溶液和细菌内毒素对照品溶液依次进行甲醇干扰预试验和甲醇干扰试验，确定甲醇在鲎试剂标示灵敏度下的最大不干扰浓度；

6、配制不同浓度的细菌内毒素加标供试品溶液，采用细菌内毒素标准溶液和细菌内毒素加标供试品溶液进行盐酸美法仑干扰试验，确定盐酸美法仑在鲎试剂标示灵敏度下的最大不干扰浓度；

7、用甲醇溶解盐酸美法仑供试品制得供试品原液，再将供试品原液逐步滴加至tris缓冲液中混匀制得符合最大不干扰浓度的供试品溶液，在供试品溶液中加入符合标示灵敏度的鲎试剂进行细菌内毒素的凝胶法检测试验。

8、进一步的，供试品原液和tris缓冲液的体积比为1：（10~30）。

9、进一步的，供试品原液中供试品的浓度为10~20mg/ml。

10、进一步的，细菌内毒素加标供试品溶液的配制方法为：

11、取盐酸美法仑供试品加入少量甲醇混匀，再逐步滴加至用tris缓冲液稀释的细菌内毒素标准溶液中混匀，即得。

12、进一步的，细菌内毒素对照品溶液的配制方法为：

13、将甲醇用内毒素检查用水系列稀释，加入浓度分别为2λ、λ、0.5λ和0.25λ的细菌内毒素标准品配制成细菌内毒素对照品溶液。

14、进一步的，甲醇在鲎试剂标示灵敏度下的最大不干扰浓度为0.0625ml/ml。

15、进一步的，盐酸美法仑在鲎试剂标示灵敏度下的最大不干扰浓度为0.625ml/ml。

16、进一步的，鲎试剂的标示灵敏度为0.125eu/ml。

17、进一步的，盐酸美法仑中细菌内毒素的检测限值为0.4eu/mg。

18、进一步的，盐酸美法仑为盐酸美法仑的原料药或制剂。

19、综上所述，本申请提供了一种盐酸美法仑中细菌内毒素的检测方法，通过采用甲醇作为盐酸美法仑供试品的预处理试剂，且采用供试品原液逐步滴加至tris缓冲液中混匀的方式配制供试品溶液进行凝胶法细菌内毒素检测，使得待测溶液基质中鲎试剂对甲醇和盐酸美法仑的耐干扰能力好，且对鲎试剂的灵敏度要求低。本申请的检测方法中盐酸美法仑中细菌内毒素的检测限值为0.4eu/mg，有效降低盐酸美法仑中细菌内毒素凝胶检测法的检测限，且具有良好的稳定性和准确度。

技术特征：

1.一种盐酸美法仑中细菌内毒素的检测方法，其特征在于，包括如下步骤：

2.根据权利要求1所述的盐酸美法仑中细菌内毒素的检测方法，其特征在于，供试品原液和tris缓冲液的体积比为1：（10~30）。

3.根据权利要求1所述的盐酸美法仑中细菌内毒素的检测方法，其特征在于，供试品原液中供试品的浓度为10~20mg/ml。

4.根据权利要求1所述的盐酸美法仑中细菌内毒素的检测方法，其特征在于，细菌内毒素加标供试品溶液的配制方法为：

5.根据权利要求1所述的盐酸美法仑中细菌内毒素的检测方法，其特征在于，细菌内毒素对照品溶液的配制方法为：

6.根据权利要求1所述的盐酸美法仑中细菌内毒素的检测方法，其特征在于，甲醇在鲎试剂标示灵敏度下的最大不干扰浓度为0.0625ml/ml。

7.根据权利要求1所述的盐酸美法仑中细菌内毒素的检测方法，其特征在于，盐酸美法仑在鲎试剂标示灵敏度下的最大不干扰浓度为0.625ml/ml。

8.根据权利要求1所述的盐酸美法仑中细菌内毒素的检测方法，其特征在于，鲎试剂的标示灵敏度为0.125eu/ml。

9.根据权利要求1所述的盐酸美法仑中细菌内毒素的检测方法，其特征在于，盐酸美法仑中细菌内毒素的检测限值为0.4eu/mg。

10.根据权利要求1所述的盐酸美法仑中细菌内毒素的检测方法，其特征在于，盐酸美法仑为盐酸美法仑的原料药或制剂。

技术总结
本申请提供了一种盐酸美法仑中细菌内毒素的检测方法，通过采用甲醇作为盐酸美法仑供试品的预处理试剂，且采用供试品原液逐步滴加至Tris缓冲液中混匀的方式配制供试品溶液进行凝胶法细菌内毒素检测，使得待测溶液基质中鲎试剂对甲醇和盐酸美法仑的耐干扰能力好，且对鲎试剂的灵敏度要求低。本申请的检测方法中盐酸美法仑中细菌内毒素的检测限值为0.4EU/mg，有效降低盐酸美法仑中细菌内毒素凝胶检测法的检测限，且具有良好的稳定性和准确度。

技术研发人员：蒋杰,张玉兰,李秀娟,左仕深
受保护的技术使用者：广州国标检验检测有限公司
技术研发日：
技术公布日：2024/1/12