用于检测幽门螺杆菌的试纸条、试剂盒及其制备方法与流程

本申请涉及生物检测领域，更具体地说，它涉及一种用于检测幽门螺杆菌的试纸条、试剂盒及其制备方法。

背景技术：

1、幽门螺杆菌(hp)是一种螺旋状细菌，其寄生在胃黏膜表面的黏液下层上皮细胞上，并不断释放出尿素酶、空泡毒素、磷脂酶、生物胺等有毒物质，使上皮细胞变性坏死、黏膜屏障破坏，导致胃炎的发生，促使胃十二指肠溃疡的形成，甚至诱发胃癌。

2、通常，具有胃溃疡疾病的患者，在感染幽门螺杆菌后更易引起胃痛、慢性胃炎的发生。由幽门螺杆菌感染导致的慢性胃炎的主要临床表现有：上腹部不适、隐痛，有时发生嗳气、反酸、恶心、呕吐的症状，病程较为缓慢，但是容易反复发作。

3、目前国内注册的幽门螺杆菌抗原免疫检测试剂盒，主要采用胶体金法和酶联免疫法。传统的胶体金法灵敏度较低，而酶联免疫法操作过程繁琐，测试时间较长容易交叉污染，且灵敏度和特异性也不够高。

技术实现思路

1、为了解决上述传统胶体金法灵敏度较低，以及elisa法操作繁琐、容易交叉污染，且特异性和灵敏度不佳的现状，本申请提供一种用于检测幽门螺杆菌的试纸条、试剂盒及其制备方法。

2、本申请采用如下的技术方案：

3、第一方面，本申请提供一种用于检测幽门螺杆菌的试纸条，其包括依次搭接的样品垫、结合垫、硝酸纤维素膜和吸水垫；

4、结合垫上包被有用胶体金和生物素进行双标记的结合抗体，结合抗体包括抗幽门螺杆菌单抗和质控物质a；

5、硝酸纤维素膜上设置有检测线和质控线，检测线包被有抗幽门螺杆菌单抗，质控线包被有能够特异性结合质控物质a的质控物质b。

6、进一步地，用胶体金和生物素对结合抗体进行双标记的方法包括：

7、将胶体金与链霉亲和素按照质量体积比1ml:(10-30)μg混合，反应后得到胶体金-sa偶联物；

8、将结合抗体与生物素-n羟基丁二酰亚胺酯按照质量比10-15:1混合，反应得到生物素化抗体；再将生物素化抗体与胶体金-sa偶联物按照质量比4-8:1混合，反应后加入生物素封闭，得到胶体金-sa-生物素-结合抗体。

9、进一步地，在制备生物素化抗体过程中，生物素-n羟基丁二酰亚胺酯为nhs-lc-lc-生物素或nhs-lc-生物素。

10、进一步地，上述检测线的制备包括：

11、将浓度为0.6-1.2mg/ml的抗幽门螺杆菌单抗，划线至硝酸纤维素膜的检测区域，划膜量为0.8～1.2ul/cm，40～50℃烘干。

12、进一步地，上述质控线的制备包括：

13、将浓度为0.8-1.2mg/ml的质控物质b，划线至硝酸纤维素膜的质控区域，划膜量为0.8～1.2ul/cm，40～50℃烘干。

14、进一步地，上述质控物质a包括鸡igy、兔igg和兔抗dnp-bsa中的任一种；质控物质b包括羊鸡igy抗体、羊抗兔igg抗体和dnp-bsa中的任一种。

15、第二方面，本申请提供一种上述用于检测幽门螺杆菌的试纸条的制备方法，其包括：

16、在聚酯膜或玻璃纤维上喷涂用胶体金和生物素进行双标记的结合抗体，得到结合垫；将抗幽门螺杆菌单抗包被在硝酸纤维膜的检测线上，将质控物质b包被在硝酸纤维膜的质控线上；

17、对样品垫进行封闭处理后，将样品垫、结合垫、硝酸纤维膜和吸水垫依次搭接进行组装。

18、进一步地，上述结合垫的制备方法包括：

19、将分别用胶体金和生物素进行双标记的抗幽门螺杆菌单抗和质控物质a混合，得到标记抗体混合液；

20、再将标记抗体混合液与含有被动阻断剂的封闭液混合，进行喷涂。

21、第三方面，本申请还提供一种用于检测幽门螺杆菌的试剂盒，其包括样本稀释液、以及上述试纸条。

22、进一步地，上述样本稀释液包括0.05-0.15wt％的表面活性剂、0.5-1.5wt％的钠盐、0.2-0.8wt％的防腐剂，余量为50mmol/l的tris缓冲液。

23、综上所述，本申请具有以下有益效果：

24、本申请提供的试纸条，包括依次搭接的样品垫、结合垫、硝酸纤维素膜和吸水垫，其中结合垫上包被有用胶体金和生物素进行双标记的结合抗体，即包被有双标记的抗幽门螺杆菌单抗和质控物质a。采用胶体金和生物素进行双标记，由于亲和素生物素系统的放大效应，使得单个胶体金上链接了更多的抗体，提高灵敏度。

25、该试纸条采用双抗体夹心法来检测生物样品中检测幽门螺杆菌的含量。其检测原理为：测试时，将待测样品液滴加至样品垫上，在毛细效应作用下，从样品垫往吸水垫方向层析，待测样品中存在的幽门螺杆菌与胶体金/生物素双标记的抗幽门螺杆菌单抗结合，形成胶体金-亲和素-生物素-抗幽门螺杆菌单抗偶联物，该偶联物在层析作用下继续迁移至硝酸纤维膜，被检测线的抗幽门螺杆菌单抗截获，形成三明治样复合物聚焦于检测线。同时双标记的质控物质a也在层析作用下迁移至质控线被质控物质b截获。通过检测线与质控线上的条带显色情况，即可得出该生物样品中有无感染检测幽门螺杆菌的结论。

26、相对于传统胶体金法的灵敏度低，以及elisa法操作繁琐、容易交叉污染，本申请提供的就检测试纸、以及检测试剂盒，将生物素亲和素系统应用于胶体金系统，极大的提高了试剂的灵敏度，并能克服由于抗原抗体比例不合适而导致的假阴性现象(即hook效应)，扩大检测浓度范围，并且检测成本低，且对检测人员的专业性要求低，有助于幽门螺杆菌感染的诊断筛查，具有广阔的应用前景。

技术特征：

1.一种用于检测幽门螺杆菌的试纸条，其特征在于，其包括依次搭接的样品垫、结合垫、硝酸纤维素膜和吸水垫；

2.根据权利要求1所述的用于检测幽门螺杆菌的试纸条，其特征在于，用胶体金和生物素对所述结合抗体进行双标记的方法包括：

3.根据权利要求2所述的用于检测幽门螺杆菌的试纸条，其特征在于，在制备所述生物素化抗体过程中，所述生物素-n羟基丁二酰亚胺酯为nhs-lc-lc-生物素或nhs-lc -生物素。

4.根据权利要求1所述的用于检测幽门螺杆菌的试纸条，其特征在于，所述检测线的制备包括：

5.根据权利要求1所述的用于检测幽门螺杆菌的试纸条，其特征在于，所述质控线的制备包括：

6.根据权利要求1所述的用于检测幽门螺杆菌的试纸条，其特征在于，所述质控物质a包括鸡igy、兔igg和兔抗dnp-bsa中的任一种；所述质控物质b包括羊鸡igy抗体、羊抗兔igg抗体和dnp-bsa中的任一种。

7.一种根据权利要求1-6任一项所述的用于检测幽门螺杆菌的试纸条的制备方法，其特征在于，其包括：在聚酯膜或玻璃纤维上喷涂用胶体金和生物素进行双标记的结合抗体，得到结合垫；

8.根据权利要求7所述的用于检测幽门螺杆菌的试纸条的制备方法，其特征在于，所述结合垫的制备方法包括：

9.一种用于检测幽门螺杆菌的试剂盒，其特征在于，其包括样本稀释液、以及如权利要求1-6任一项所述的试纸条。

10.根据权利要求9所述的用于检测幽门螺杆菌的试剂盒，其特征在于，所述样本稀释液包括0.05-0.15 wt%的表面活性剂、0.5-1.5 wt%的钠盐、0.2-0.8wt%的防腐剂，余量为50mmol/l的 tris缓冲液。

技术总结
本申请涉及生物检测领域，具体公开了一种用于检测幽门螺杆菌的试纸条、试剂盒及其制备方法。该试纸条包括依次搭接的样品垫、结合垫、硝酸纤维素膜和吸水垫；结合垫上包被有用胶体金和生物素进行双标记的结合抗体，结合抗体包括抗幽门螺杆菌单抗和质控物质A；硝酸纤维素膜上设置有检测线和质控线，检测线包被有抗幽门螺杆菌单抗，质控线包被有能够特异性结合质控物质A的质控物质B。相对于传统胶体金法和ELISA法，这种试纸条的灵敏度高，检测浓度范围大，并且检测成本低，且对检测人员的专业性要求低，有助于幽门螺杆菌感染的诊断筛查，具有广阔的应用前景。

技术研发人员：尹俊,赖楚明
受保护的技术使用者：深圳市天大生物医疗器械有限公司
技术研发日：
技术公布日：2024/1/12