一种快速建立HPLC梯度洗脱程序的方法

本发明涉及hplc检测，具体涉及一种快速建立hplc梯度洗脱程序的方法。

背景技术：

1、hplc已成为药学、化学、医学、公卫、生物、农学、商检、法检等学科领域的通用分离分析仪器设备，其主要用于化合物的定性和定量。不同厂家的hplc仪器和工作站操作均不相同，但只需做几次即可熟练掌握仪器和工作站操作。然而hplc分析最关键最难掌握的是分析方法的建立，特别是诸如中药之类的复杂样品，往往有10个以上的化学成分，要想将其完全分开有一定难度，对于含有未知样品或无分析文献报道的样品检测，往往茫无头绪，不知该如何入手。很多hplc初学者只会参考文献条件，但多数情况下我们现有的色谱柱与文献不一致，特别是中华人民共和国药典(以下简称中国药典)，绝大多数没有提供色谱柱填料详细信息。从而造成我们参考文献或中国药典色谱条件往往难以重现，这时就需要重建色谱条件。很多学生或初学者经常消耗大量时间在摸索hplc的分析条件上，特别是其梯度洗脱程序的建立，尤为费时费力。

技术实现思路

1、针对现有技术中的上述问题，本发明提供一种快速建立hplc梯度洗脱程序的方法，以解决现有技术梯度洗脱程序建立困难的技术问题。

2、本发明采用的技术方案如下：

3、一种快速建立hplc梯度洗脱程序的方法，采用全谱-展开-加节点三步法，具体步骤如下：

4、(1)全谱：以乙腈-0.1％磷酸水溶液为流动相，在20min内，乙腈比例由5％线性升到100％；得到的全谱图用于快速获取样品的所有色谱峰信息，同时确定后续展开分析的展开时间、初始比例和终止比例；

5、(2)展开：

6、a.初始比例：在步骤(1)所得全谱图中，在设定波长下，将除溶剂峰以外第一个肉眼可见色谱峰的保留时间往前推3～5min，在全谱梯度图上对应的比例定为初始比例；

7、b.终止比例：在步骤(1)所得全谱图中，在设定波长下，将除流动相波动峰以外最后一个肉眼可见色谱峰的保留时间往前推3～5min，在全谱梯度图上对应的比例定为终止比例；

8、再根据色谱峰数量和疏密选择15min、20min、25min、30min、35min、40min、45min、50min、60min中的一个作为展开时间，得到的展开图用于确定后续加节点的位置；

9、(3)加节点：

10、a.提高色谱峰分离度：对于步骤(2)所得的展开图，若前面部分色谱峰密集或分离度较低，后面部分色谱峰相对稀疏，在原梯度线上方适宜位置加一节点，将前面部分梯度线坡度降低，后面部分梯度线坡度升高，同时初始比例、终止比例和展开时间保持不变；若是后面部分色谱峰密集或分离度较低，前面部分色谱峰相对稀疏，在原梯度线下方适宜位置加一节点，将后面部分梯度线坡度降低，前面部分梯度线坡度升高，同时初始比例、终止比例和展开时间保持不变；如果前后色谱峰均较多且密集，则不用添加节点，初始比例和终止比例保持不变，直接增加展开时间即可；

11、b.缩短分析时间：对于步骤(2)所得的展开图，若前面部分色谱峰分离较好，而后面部分色谱峰相对稀疏，在前面部分分离较好的最后一个色谱峰前0～4min内，在其对应的梯度线上添加一节点，前面部分梯度线保持不变，保持终止比例不变或乙腈增加5％，缩短洗脱时间即可；若色谱峰分离较好，但中间有超过10min的间隔，则在前面部分的最后一个色谱峰前0～4min内，在其对应的梯度线上添加一节点，前面部分梯度线保持不变，中间部分在1～5min内快速提高梯度线坡度，直至后面部分的第一个峰前推3～5min对应的比例为止，再添加一节点，保持终止比例不变或乙腈增加5％，缩短洗脱时间即可；

12、c.冲出杂质峰：若乙腈终止比例不够，样品洗脱后还有杂质峰，当杂质峰对后续样品有干扰时，则在原梯度后面追加节点，在1～15min内乙腈比例提高至90％～100％，保持4～5min，再在1min内返回初始比例平衡4～5min。

13、作为优选地，hplc所用色谱柱为以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂的常规高效液相色谱柱，内径为4.6mm，长度为250mm。

14、作为优选地，步骤(1)中，若样品在20min后还有色谱峰或20min仍未出峰，则采用100％乙腈继续洗脱5～10min。

15、作为优选地，步骤(2)中关于初始比例的设置，以全谱图中除溶剂峰以外第一个肉眼可见色谱峰为依据：第一个肉眼可见色谱峰在10min以内，前推5min；第一个肉眼可见色谱峰在10～15min，前推4～5min，趋近10min取5，趋近15min取4；第一个肉眼可见色谱峰在15～20min，前推3～4min，趋近15min取4，趋近20min取3，在全谱梯度图上对应的比例作为初始比例，乙腈比例取值舍入为最接近的5的倍数。

16、作为优选地，步骤(2)中关于终止比例的设置，以全谱图中除流动相波动峰以外最后一个肉眼可见色谱峰为依据：最后一个肉眼可见色谱峰在5～10min以内，前推5min；最后一个肉眼可见色谱峰在10～15min以内，前推4～5min，趋近10min取5，趋近15min取4；最后一个肉眼可见色谱峰在15～20min以内，前推3～4min，趋近15min取4，趋近20min取3，在全谱梯度图上对应的比例作为终止比例，乙腈比例取值舍入为最接近的5的倍数；最后一个肉眼可见需要分离的色谱峰在20～25min以内，乙腈终止比例设90％～100％。

17、作为优选地，步骤(3)中，如果需要微移色谱峰或需要精确控制色谱峰的出峰时间，则继续微调初始比例或终止比例，以及进一步微调节点位置和比例或追加节点。

18、综上所述，相比于现有技术，本发明具有如下优点及有益效果：

19、1.本发明适合快速建立中药样品、复杂样品或未知样品的hplc梯度洗脱程序和色谱条件，也可快速获取西药类简单成分样品的等度比例，在hplc分析方法开发领域具有广泛的应用价值和教学价值。

20、2.本发明通过三步法即可快速初步确定比较理想的hplc梯度洗脱程序，部分样品甚至只需一步或两步即可获得相对理想的hplc梯度洗脱程序和色谱条件。

21、3.本发明不涉及复杂计算，只需绘出excel网格线，再配合直线工具即可快速确定hplc梯度洗脱程序。

22、4.通过和中国药典法色谱条件的对比发现，三步法建立的色谱条件更加简洁明了，其比药典条件具有明显的优势，三步法可用于后续中国药典法色谱条件的重建和简化，为后期中国药典色谱条件的改进和优化提供了参考。

技术特征：

1.一种快速建立hplc梯度洗脱程序的方法，其特征在于，采用全谱-展开-加节点三步法，具体步骤如下：

2.如权利要求1所述的快速建立hplc梯度洗脱程序的方法，其特征在于，hplc所用色谱柱为以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂的常规高效液相色谱柱，内径为4.6mm，长度为250mm。

3.如权利要求1所述的快速建立hplc梯度洗脱程序的方法，其特征在于，步骤(1)中，若样品在20min后还有色谱峰或20min仍未出峰，则采用100％乙腈继续洗脱5～10min。

4.如权利要求1所述的快速建立hplc梯度洗脱程序的方法，其特征在于，步骤(2)中关于初始比例的设置，以全谱图中除溶剂峰以外第一个肉眼可见色谱峰为依据：第一个肉眼可见色谱峰在10min以内，前推5min；第一个肉眼可见色谱峰在10～15min，前推4～5min，趋近10min取5，趋近15min取4；第一个肉眼可见色谱峰在15～20min，前推3～4min，趋近15min取4，趋近20min取3，在全谱梯度图上对应的比例作为初始比例，乙腈比例取值舍入为最接近的5的倍数。

5.如权利要求1所述的快速建立hplc梯度洗脱程序的方法，其特征在于，步骤(2)中关于终止比例的设置，以全谱图中除流动相波动峰以外最后一个肉眼可见色谱峰为依据：最后一个肉眼可见色谱峰在5～10min以内，前推5min；最后一个肉眼可见色谱峰在10～15min以内，前推4～5min，趋近10min取5，趋近15min取4；最后一个肉眼可见色谱峰在15～20min以内，前推3～4min，趋近15min取4，趋近20min取3，在全谱梯度图上对应的比例作为终止比例，乙腈比例取值舍入为最接近的5的倍数；最后一个肉眼可见需要分离的色谱峰在20～25min以内，乙腈终止比例设90％～100％。

6.如权利要求1所述的快速建立hplc梯度洗脱程序的方法，其特征在于，步骤(3)中，如果需要微移色谱峰或需要精确控制色谱峰的出峰时间，则继续微调初始比例或终止比例，以及进一步微调节点位置和比例或追加节点。

技术总结
本发明公开了一种快速建立HPLC梯度洗脱程序的方法，涉及HPLC检测技术领域。本发明采用全谱‑展开‑加节点三步法；第一步，通过拉全谱，在梯度图上快速确定初始比例和终止比例；第二步，利用初始比例和终止比例，将样品展开到合适分析时间；第三步，根据色谱峰的疏密加节点，进一步细分未分开的色谱峰。本发明适合快速建立中药样品、复杂样品或未知样品的HPLC梯度洗脱程序，也可快速获取简单成分样品的等度比例，具有广泛的应用价值和教学价值。

技术研发人员：杨世艳,何兵,何孟原
受保护的技术使用者：西南医科大学附属中医医院
技术研发日：
技术公布日：2024/1/14