一种用于定量FRET成像的激发光强度自动校准装置及方法

本发明属于荧光共振能量转移检测的，具体涉及一种用于定量fret成像的激发光强度自动校准装置及方法。

背景技术：

1、荧光共振能量转移(fret)显微成像技术可以实时原位检测活细胞内蛋白质的相互作用，已经成为在活细胞中研究生化分子动态过程的重要工具。基于受体敏化发射的fret方法(e-fret)由于高灵敏性、低损伤和快速的特性被认为是最适合活细胞动态监测的fret定量检测技术。在e-fret的实验系统中，多色激发光源的强度波动会导致光谱串扰系数的变化，而光谱串扰系数偏差对应的会导致ed的测量误差。因此在fret显微成像过程中保持供体激发光和受体激发光相对强度关系的稳定性对于定量fret至关重要。基于led或激光的多波长合束光源由于亮度高、寿命长、控制灵活等特点正在取代传统卤素灯、汞灯等宽谱光源成为主流的荧光显微镜光源。在多波长合束光源的使用过程中，光源以及合束器件容易收到环境温度和震动等影响，使得进入成像系统中的激发光强产生波动。多波长合束光源作为fret光源时，其相互独立的光强调制无法满足供体激发光和受体激发光相对强度关系的自动校正和补偿。以上问题使得多波长合束光源在作为fret实验系统激发光源时需要重复对光谱串扰系数和系统参数进行校正，给进行定量fret检测带来不便。

技术实现思路

1、本发明的主要目的在于提供一种用于定量fret成像的激发光强度自动校准装置及方法来克服或至少减轻上述现有技术缺陷。

2、为了达到上述目的，本发明采用以下技术方案：

3、本发明的一个方面，提供了一种用于定量fret成像的激发光强度自动校准装置，包括fret多波长合束光源、光束分束装置、光强探测器、下位机以及上位机；

4、所述fret多波长合束光源用于产生fret显微成像过程中供体通道和受体通道的激发光；

5、所述光束分束装置用于接收fret多波长合束光源产生的激发光并按照预设比例进行分光；

6、所述光强探测器用于探测分光光路中供体激发光和受体激发光的部分光强；

7、所述上位机分别与下位机、光强探测器连接，用于接收光强探测器发送的通道的激发光强信息并计算d/a通道光强比值偏差，将光强补偿指令发送至下位机；

8、所述下位机与fret多波长合束光源相连，用于根据上位机的指令进行光强控制。

9、作为优选的技术方案，所述fret多波长合束光源包括至少两种不同激发波长的光源：供体激发光源，以及受体激发光源；所述fret多波长合束光源还利用下位机进行通道切换。

10、作为优选的技术方案，所述光束分束装置设置于fret多波长合束光源的出射光路前，其分光光路的一路导入到光强探测器中，另一路作为fret光源输出光。

11、作为优选的技术方案，所述下位机分别通过串口通信与光强探测器、上位机连接；所述下位机在接收到上位机的控制指令后，通过数模转换以模拟电压调制外触发的方式对fret多波长合束光源进行通道选择和光强控制。

12、本发明的另一个方面，还提供了一种用于定量fret成像的激发光强度自动校准方法，包括以下步骤：

13、获取d/a通道光源基线值、染料及通道光强比配置；

14、根据d/a通道光源基线值拟合得到d/a通道光源基线线性区间；

15、根据光强比配置得到d/a通道光强线性区间的映射关系并获得当前配置下fret激发光强度调整函数；

16、根据fret激发光强度调整函数遍历调制量程范围，得到所有点的d/a通道光强理论值，并利用光强探测器测量d/a通道光强实际值；

17、根据d/a通道光强理论值和实际值，计算d/a通道光强比值偏差；

18、判断d/a通道光强比偏差是否小于设定阈值：

19、当偏差大于阈值时，通过闭环控制补偿d/a通道光强线性区间fret激发光强度调整函数参数并重新测量、计算d/a通道光强比值偏差；

20、当偏差小于阈值时，根据上述步骤中定量荧光共振能量转移成像的激发光强度自动校准结果判断串扰系数是否已知；当串扰系数未知时重新测量该通道染料及光强比配置对应的串扰系数，当串扰系数已知时保存当前配置下fret激发光强度调整函数以及串扰系数结果。

21、作为优选的技术方案，所述拟合得到d/a通道光源基线线性区间，具体为：

22、采用sigmoid函数通过最小二乘拟合d/a通道光源基线，选取所得sigmoid函数拟合结果的二阶导数的拐点作为线性范围区间的端点得到光源基线线性区间。

23、作为优选的技术方案，所述当前配置下fret激发光强度调整函数，具体为：

24、以上位机的强度调制指令作为自变量，以fret激发光根据d/a通道光强线性区间的映射关系得到的d/a通道激发光强作为因变量构建函数映射关系，即为当前配置下fret激发光强度调整函数。

25、作为优选的技术方案，所述计算d/a通道光强比值偏差，具体为：

26、所述d/a通道光强比值偏差为fret激发光强度调整函数映射的d/a通道光强理论值和光强探测器所测得的d/a通道光强实际值的差值。

27、作为优选的技术方案，所述串扰系数通过单转供体的样本和单转受体的样本测定，具体为：

28、a＝ida(a)/iaa(a)

29、b＝idd(a)/iaa(a)

30、c＝ia((d)/idd(d）

31、d＝ida(d)/idd(d)

32、其中，串扰系数a和b是对ida和idd通道的受体荧光串扰进行校正的参数，串扰系数c和d是对iaa和ida通道的受体荧光串扰进行校正的参数；idd是使用激发供体时在供体通道探测到的荧光强度，ida是供体激发时在受体通道探测到的荧光强度；iaa是受体激发时在受体通道探测到的荧光强度；括号中表示测量的生物样本，其中d代表单转供体的样本，a代表单转受体的样本。

33、本发明与现有技术相比，具有如下优点和有益效果：

34、(1)本发明为独立模块设计，可以方便的放置于任意多波长合束光源的输出光路，将多种类型的多波长合束光源校准作为fret实验系统激发光源。光源类型包括具有对应光谱的led或激光器以及通过滤光轮或滤光载波片从宽带光谱中滤出期望激发波长的宽带光源。

35、(2)本发明不仅可以校正补偿多波长合束光源激发光强波动，还可以根据fret实验要求灵活控制供受体激发光输出强度及供受体强度比，并自动加载当前配置下fret系统的校正因子，解决了在实验中需要重复对光谱串扰系数和系统参数进行校正的问题，进而为定量fret检测带来方便。

技术特征：

1.一种用于定量fret成像的激发光强度自动校准装置，其特征在于，包括fret多波长合束光源、光束分束装置、光强探测器、下位机以及上位机；

2.根据权利要求1所述的一种用于定量fret成像的激发光强度自动校准装置，其特征在于，所述fret多波长合束光源包括至少两种不同激发波长的光源：供体激发光源，以及受体激发光源；所述fret多波长合束光源还利用下位机进行通道切换。

3.根据权利要求1所述的一种用于定量fret成像的激发光强度自动校准装置，其特征在于，所述光束分束装置设置于fret多波长合束光源的出射光路前，其分光光路的一路导入到光强探测器中，另一路作为fret光源输出光。

4.根据权利要求1所述的一种用于定量fret成像的激发光强度自动校准装置，其特征在于，所述下位机分别通过串口通信与光强探测器、上位机连接；所述下位机在接收到上位机的控制指令后，通过数模转换以模拟电压调制外触发的方式对fret多波长合束光源进行通道选择和光强控制。

5.一种用于定量fret成像的激发光强度自动校准方法，其特征在于，包括以下步骤：

6.根据权利要求5所述的一种用于定量fret成像的激发光强度自动校准方法，其特征在于，所述拟合得到d/a通道光源基线线性区间，具体为：

7.根据权利要求5所述的一种用于定量fret成像的激发光强度自动校准方法，其特征在于，所述当前配置下fret激发光强度调整函数，具体为：

8.根据权利要求5所述的一种用于定量fret成像的激发光强度自动校准方法，其特征在于，所述计算d/a通道光强比值偏差，具体为：

9.根据权利要求5所述的一种用于定量fret成像的激发光强度自动校准方法，其特征在于，所述串扰系数通过单转供体的样本和单转受体的样本测定，具体为：

技术总结
本发明公开了一种用于定量FRET成像的激发光强度自动校准装置及方法，该装置包括FRET多波长合束光源，光束分束装置，光强探测器，下位机以及上位机；FRET多波长合束光源用于产生FRET显微成像过程中供体通道和受体通道的激发光，光束分束装置用于对激发光进行分光，光强探测器用于用于探测该分光光路供受体激发光的部分光强，下位机通过接收上位机的指令完成通道选择和光强控制，上位机用于收集光强探测器发送的通道的激发光强信息并进行处理，将补偿指令发送给下位机。本发明为独立模块设计，可以方便的放置于任意多波长合束光源的输出光路，灵活适用于不同的实验环境；可以根据FRET实验要求控制供受体激发光输出强度及供受体强度比，适合定量FRET检测。

技术研发人员：罗泽伟,孔梦婷,陈同生
受保护的技术使用者：华南师范大学
技术研发日：
技术公布日：2024/1/14