一种基于超高效液相色谱法检测微藻中炔雌醇的方法

本发明属于雌激素检测领域，具体涉及一种基于超高效液相色谱法检测微藻中炔雌醇的方法。

背景技术：

1、炔雌醇(ee2)由雌酚酮经乙炔化制成，含有炔基，在乙醇、丙醇、甲醇或乙醚中易溶，在水中不溶。目前，大多采用乙酸乙酯萃取法来萃取炔雌醇，乙酸乙酯法是取2ml培养物加入1ml乙酸乙酯并振荡1分钟，然后将混合物以2000rpm离心15秒以收集有机层，水层每次用1ml乙酸乙酯萃取四次，收集所有有机层；有机层用无水硫酸钠脱水，在45℃下用氮气干燥并溶解在200μl乙腈中，得到色谱检测的样品(参见peng w,fu y,jia b,sun x,wang y,deng z,lin s,liang r.metabolism analysis of 17α-ethynylestradiol bypseudomonas citronellolis sjte-3and identification of the functional genes.jhazard mater.2022feb 5；423(pt a):127045.doi:10.1016/j.jhazmat.2021.127045.epub 2021aug 30.pmid:34488099)。检测样品的技术有采用hplc(高效液相色谱法)检测和gc-ms(气相色谱法-质谱法联用)检测，而gc(气相色谱法)样品前处理还需要多一个样品衍生化的步骤来增加样品的挥发性和稳定性，hplc检测条件为205nm波长，柱温35℃，使用不同比例的水和乙腈作流动相；gc-ms检测条件为氦气载气，程序升温，esi电子源，电子轰击能力70ev，全扫描模式(m/z 50-500)(参见ye x,wang h,kanj,li j,huang t,xiong g,hu z.a novel 17β-hydroxysteroid dehydrogenase inrhodococcus sp.p14 for transforming 17β-estradiol to estrone.chem biolinteract.2017oct 1；276:105-112.doi:10.1016/j.cbi.2017.06.010.epub 2017jun13.pmid:28619386)。

2、因此，现有技术中采用乙酸乙酯等有机溶剂萃取培养物中的炔雌醇，还需通过真空干燥浓缩后，加有机相水相复溶得到样品，过程太繁杂耗时，易于流失样品，增大误差；而气相色谱分析样品前处理需衍生化，过程繁杂且危险性较大。液相色谱非梯度洗脱方法检测出的化合物种类较少，不能有效分离炔雌醇。

技术实现思路

1、本发明旨在至少解决上述现有技术中存在的技术问题之一。为此，本发明提出一种基于超高效液相色谱法检测微藻中炔雌醇的方法，该方法先通过甲醇溶剂反应炔雌醇暴露后的微藻液，外加涡旋破碎细胞，甲醇得以快速有效萃取出微藻细胞中的炔雌醇；然后通过超高效液相色谱梯度洗脱程序与多波长检测尽可能多的检测出炔雌醇的疑似代谢产物，高效检测并定量炔雌醇及其产物。

2、为解决上述技术问题，本发明的第一方面提供了一种检测微藻中炔雌醇的方法，采用超高效液相色谱法梯度洗脱程序进行检测；所述梯度洗脱程序为：0-2.5min时使用体积浓度为10％的甲醇，2.5-5min时使甲醇浓度上升到40％，5-7.5min持续使用40％甲醇，7.5-8min使甲醇浓度上升到90％，8-17min持续使用90％甲醇，17-17.5min使甲醇浓度下降到10％，运行至20min，结束。

3、具体地，本发明采用超高液相色谱法(uplc)并设置不同浓度梯度的洗脱程序，以高效检测并定量微藻中的炔雌醇及其产物，设置不同浓度梯度的炔雌醇，进行超高液相色谱检测，不同浓度的炔雌醇在色谱结果图中的峰面积大小会不同，以峰面积为横坐标、炔雌醇浓度为纵坐标建立标准曲线，以达到定量炔雌醇的目的。根据比对炔雌醇标准品溶液，空白的色谱图中的峰，从而预测炔雌醇可能有多少种降解产物。

4、作为上述方案的进一步改进，在所述超高效液相色谱法的色谱条件中：流动相a包括超纯水，流动相b包括甲醇。

5、作为上述方案的进一步改进，所述流动相a和流动相b的体积比为(0.1-9)：1。

6、作为上述方案的进一步改进，所述流动相a和流动相b的流速为0.05-0.3ml/min，进样量为1-10ul。

7、作为上述方案的进一步改进，在所述超高效液相色谱法的色谱条件中，波长为220-280nm。

8、作为上述方案的进一步改进，在所述超高效液相色谱法的色谱条件中，色谱柱为c185μm 4.6x 250mm，柱温为30-40℃。

9、作为上述方案的进一步改进，所述微藻包括淡水微藻。

10、优选的，所述淡水微藻为四尾栅藻。

11、作为上述方案的进一步改进，所述的检测微藻中炔雌醇的方法，具体包括以下步骤：

12、(1)在炔雌醇暴露后的微藻液中加入甲醇，进行涡旋，萃取出微藻中的炔雌醇，得萃取液；

13、(2)将步骤(1)制得的萃取液进行过滤、冷冻后，得炔雌醇样品溶液；

14、(3)采用超高效液相色谱法检测步骤(2)制得的炔雌醇样品溶液。

15、具体地，本发明通过甲醇溶剂反应炔雌醇暴露后的微藻液，外加涡旋破碎细胞，使甲醇得以快速有效萃取出微藻细胞中的炔雌醇；同时，采用超高效液相色谱梯度洗脱程序与多波长检测，以尽可能多的检测出炔雌醇的疑似代谢产物，从而高效检测并定量炔雌醇及其产物。

16、优选的，步骤(2)中的过滤采用0.22μm滤膜进行过滤。

17、作为上述方案的进一步改进，所述炔雌醇暴露后的微藻液的制备过程为：在bg11培养基中加入炔雌醇，使bg11培养基中决雌醇的暴露浓度为1-15mg/l；进行灭菌后，冷却至室温，在无菌操作台完成无菌转接微藻，使微藻液的浓度为1×107-10×107个微藻细胞/ml，制得。

18、优选的，所述bg11培养基的配制过程为，将bg11培养基配方粉末溶解于超纯水中而制得。

19、具体地，本发明利用炔雌醇在有机相甲醇和水相中的溶解度不同，炔雌醇易溶于甲醇，在水中的溶解度较低，而藻液中含有的bg11培养基为水相，故可采用甲醇去萃取藻液中的炔雌醇。

20、作为上述方案的进一步改进，步骤(1)中，所述微藻液与所述甲醇的体积比为(0.5-1)：1。

21、本发明的上述技术方案相对于现有技术，至少具有如下技术效果或优点：

22、本发明采用超高液相色谱法对微藻中的炔雌醇进行检测，通过设置特定的梯度洗脱程序，以高效检测并定量微藻中的炔雌醇；并根据比对炔雌醇标准品溶液，空白的色谱图中的峰，从而预测炔雌醇可能的降解产物。

技术特征：

1.一种检测微藻中炔雌醇的方法，其特征在于，采用超高效液相色谱法梯度洗脱程序进行检测；所述梯度洗脱程序为：0-2.5min时使用体积浓度为10％的甲醇，2.5-5min时使甲醇浓度上升到40％，5-7.5min持续使用40％甲醇，7.5-8min使甲醇浓度上升到90％，8-17min持续使用90％甲醇，17-17.5min使甲醇浓度下降到10％，运行至20min，结束。

2.根据权利要求1所述的检测微藻中炔雌醇的方法，其特征在于，在所述超高效液相色谱法的色谱条件中：流动相a包括超纯水，流动相b包括甲醇。

3.根据权利要求2所述的检测微藻中炔雌醇的方法，其特征在于，所述流动相a和流动相b的体积比为(0.1-9)：1。

4.根据权利要求2所述的检测微藻中炔雌醇的方法，其特征在于，所述流动相a和流动相b的流速为0.05-0.3ml/min，进样量为1-10ul。

5.根据权利要求1所述的检测微藻中炔雌醇的方法，其特征在于，在所述超高效液相色谱法的色谱条件中，波长为220-280nm。

6.根据权利要求1所述的检测微藻中炔雌醇的方法，其特征在于，在所述超高效液相色谱法的色谱条件中，色谱柱为c18 5μm 4.6x 250mm，柱温为30-40℃。

7.根据权利要求1所述的检测微藻中炔雌醇的方法，其特征在于，所述微藻包括淡水微藻。

8.根据权利要求1至7任意一项所述的检测微藻中炔雌醇的方法，其特征在于，具体包括以下步骤：

9.根据权利要求8所述的检测微藻中炔雌醇的方法，其特征在于，所述炔雌醇暴露后的微藻液的制备过程为：在bg11培养基中加入炔雌醇，使bg11培养基中决雌醇的暴露浓度为10-20mg/l；进行灭菌后，冷却至室温，在无菌操作台完成无菌转接微藻，使微藻液的浓度为3×107-8×107个微藻细胞/ml，制得。

10.根据权利要求8所述的检测微藻中炔雌醇的方法，其特征在于，步骤(1)中，所述微藻液与所述甲醇的体积比为(0.5-1)：1。

技术总结
本发明属于雌激素检测领域，具体公开了一种基于超高效液相色谱法检测微藻中炔雌醇的方法。该方法采用超高效液相色谱法梯度洗脱程序进行检测；其中：梯度洗脱程序为：0‑2.5min时使用10％的甲醇，2.5‑5min时使甲醇比例上升到40％，5‑7.5min持续使用40％甲醇，7.5‑8min使甲醇比例上升到90％，8‑17min持续使用90％甲醇，17‑17.5min使甲醇比例下降到10％，运行至20min，结束。本发明采用超高液相色谱法对微藻中的炔雌醇进行检测，通过设置特定的梯度洗脱程序，以高效检测并定量微藻中的炔雌醇及其产物；并根据比对炔雌醇标准品溶液，空白的色谱图中的峰，从而预测炔雌醇可能的降解产物。

技术研发人员：王振,吴小敏,王裕文,刘晓娟
受保护的技术使用者：汕头大学
技术研发日：
技术公布日：2024/1/13