一种用于犬病毒抗体三联检的检测试剂盒及其制备方法与流程

本发明涉及体外诊断，具体的说，涉及一种用于犬病毒抗体三联检的检测试剂盒及其制备方法。

背景技术：

1、随着人们生活水平的提高，越来越多的人喜爱饲养小动物作为自己的宠物，人与动物的密切接触随之而来的是宠物疫病的发病率逐渐增加，特别是一些犬猫宠物源性人畜共患疫病，对人们的身体健康和生命安全构成严重威胁。为了宠物和人类的健康，珍爱生命，科学饲养，保护环境，宠物疫病的防控也显得越来越重要。

2、犬细小病毒(canineparvovirus，cpv)是单链小dna病毒。病毒为等轴对称的二十面体，外观呈圆形或六边形，无囊膜，粒径为21-24nm。该病毒在1977年首次从患有肠炎的病犬体内分离获得。主要以呕吐、出血性肠炎、白细胞减少为主要特征，幼犬的易感性很高，可引起心肌炎，发病率为50％以上，死亡率在50％以内，对犬业、经济动物养殖业影响很大，因此要建立快速有效的检测方法，并针对该病进行有效治疗。

3、犬腺状病毒(canineadenovirus，cav)是哺乳动物腺病毒属中致病性最强的一种病毒，有两个血清型。其病毒基因组为单分子的、线状、双股dna，呈线状盘曲于衣壳之中，cav-i的基因组长约31kb，cav-ⅱ的基因组长约32kb，二者同源性为70-75%。i型既可引起犬传染性肝炎，还可引起狐狸脑炎，故又称狐狸脑炎与犬传染性肝炎病。ⅱ型可引起犬传染性喉气管炎和肠炎。犬腺病毒同其它腺病毒一样，病毒广泛分布于全世界，引起了各国重视，其引起的感染是养犬业、毛皮经济动物养殖业危害最大的疫病之一。

4、犬瘟热病毒(caninedistempervirus，cdv)是副粘病毒科的一种带包膜ssrna(单链rna)病毒。cdv与牛瘟等病毒一样，属于麻疹病毒属。除了人畜共患的狂犬病毒外，犬瘟热病毒是犬类最严重的病毒性疾病，已鉴定出多种病毒株。通过吸入或接触感染犬的鼻腔和眼部分泌物、尿液和粪便传播，也可经胎盘传播，犬舍清洁用品等被污染后也可能在犬群之间传播病毒。cdv在宿主中传播，并导致不同器官系统的损伤。最后，病毒血凝素的不同决定了细胞的趋向性和细胞致病性。因此，临床症状是多变的。高达50%的病例表现为亚临床症状。总体死亡率在30-80%之间，在未接种疫苗的动物、幼犬、以及并发肺炎或脑炎的案例中死亡率尤其高。

5、目前，已经相对成熟的检测方法有抗体的血清学试验，比如血凝试验、血凝抑制试验、琼脂扩散试验等，除此之外，elisa的方法也相对广泛，但是elisa方法的操作相对复杂，而且需要配合酶标仪来判读结果，整体反应时间长，因此不适用于基层的快速诊断的需求；层析法等待时间较长，诊断速度慢、诊断效率低，无法满足客户肉眼观察的需求。另外，大多数的试剂是需要2-8℃冷藏贮存，需要冷链运输，增加运输成本，无法满足室温储存的需要。再者，目前的检测都是每种病毒分别检测，检测程序长。

技术实现思路

1、本发明的目的在于提供一种用于犬病毒抗体三联检的检测试剂盒及其制备方法，通过在硝酸纤维素膜上同时包被犬细小病毒、犬瘟热病毒、犬腺病毒相关抗原、羊抗鼠抗体四个条带，并采用酶或胶体金标spa抗体，应用免疫渗滤法原理检测犬血清中的犬细小病毒、犬瘟热病毒、犬腺病毒免疫抗体，实现快速检测、室温储存的目的，克服了现有检测技术操作复杂、繁琐、无法用全血检测、检测时间长、需要仪器、需要冷链运输的不足。

2、为实现上述目的，本发明采用的技术方案如下：一种用于犬病毒抗体三联检的检测试剂盒，包括检测卡和酶或胶体金标spa抗体溶液，检测卡包括试纸条，试纸条包括吸水垫，吸水垫上设有硝酸纤维素膜，所述酶是辣根过氧化物酶或碱性磷酸酶或纳米酶；

3、辣根过氧化物酶标spa抗体溶液的制备方法包括如下步骤：

4、（1）预先将辣根过氧化物酶按照5mg/ml溶于超纯水中得到辣根过氧化物酶溶液，将高碘酸钠溶液10mg/ml加入辣根过氧化物酶溶液中，室温下避光轻搅40min，用ph4.4的醋酸盐缓冲液0.1m透析24h，期间换液3次；

5、（2）加入0.1m的碳酸盐缓冲液；

6、（3）加入5mg/ml的spa抗体，辣根过氧化物酶与spa抗体的质量比为2:1，室温下避光轻轻搅动5h；

7、（4）加入5mg/ml的硼氢化钠溶液，室温反应5h，观察反应液中无气泡溢出；

8、（5）用ph7.4的pbs缓冲液透析24h，期间换液3次，得到辣根过氧化物酶标spa抗体；

9、（6）按照使用比例将辣根过氧化物酶标spa抗体用辣根过氧化物酶标spa抗体稀释液稀释后得辣根过氧化物酶标spa抗体溶液。

10、作为一种优化方案，碱性磷酸酶标spa抗体溶液的制备方法包括如下步骤：

11、（1）预先将碱性磷酸酶按照5mg/ml溶于超纯水中得到碱性磷酸酶溶液，加入10mg/ml的spa抗体，碱性磷酸酶与spa抗体的质量比为2:1，室温下避光反应6h，之后用ph7.4的pbs缓冲液透析24h，期间换液3次；

12、（2）加入30ul 25%的戊二醛溶液，4℃反应20h；

13、（3）用ph7.4的pbs缓冲液透析24h，期间换液3次，得到碱性磷酸酶标spa抗体；

14、（4）按照使用比例将碱性磷酸酶标spa抗体用碱性磷酸酶标spa抗体稀释液稀释后得碱性磷酸酶标spa抗体溶液。

15、作为一种优化方案，纳米酶标spa抗体溶液的制备方法包括如下步骤：

16、（1）将5mg edc和5mg nhs涡旋溶解于1ml去离子水中，加入5mg纳米酶，在室温下孵育1h，收集功能化的纳米酶，用超纯水洗涤两次；

17、（2）收集沉淀，加入50mm ph6.0 naac缓冲液，然后加入1mg/ml spa抗体，将混合物涡旋混匀，在4℃下孵化24h；

18、（3）用0.1m ph7.4的pbs缓冲液洗涤两次，得到纳米酶标spa抗体；

19、（4）再次用0.1m ph7.4的pbs缓冲液洗涤，然后分散到1ml纳米酶标spa抗体稀释液中得纳米酶标spa抗体溶液。

20、作为一种优化方案，胶体金标spa抗体溶液的制备方法包括如下步骤：

21、采用柠檬酸三钠还原法制备胶体金溶液，加入0.1mol/l k2co3调ph至6.0，逐滴加入适量的2mg/ml的spa抗体，得终浓度为4μg/ml的胶体金，继续搅拌10min；缓慢加入适量的2%的聚乙二醇20000，加入聚乙二醇20000的体积为整个溶液体积的1/10，继续搅拌10min；加入适量的5%的bsa，使bsa的终浓度为0.5%，继续搅拌10min，静置20min，然后将该溶液以10000r/min在4℃条件下离心15min，弃上清留沉淀，沉淀用胶体金标spa抗体稀释液稀释至离心前溶液体积的1/20，即为胶体金标spa抗体溶液。

22、作为一种优化方案，所述辣根过氧化物酶标spa抗体稀释液包括50mm pbs缓冲液、0.1%bsa、1%海藻糖、0.1%pvp和0.1%proclin-300。

23、作为一种优化方案，所述碱性磷酸酶标spa抗体稀释液包括50mm tbs缓冲液、0.1%bsa、0.5%海藻糖、0.05%pva和0.1%proclin-300。

24、作为一种优化方案，所述纳米酶标spa抗体稀释液包括50mm pbs缓冲液、3%bsa、0.5%蔗糖、0.05%peg和0.1%proclin-300。

25、作为一种优化方案，所述胶体金标spa抗体稀释液包括50mm ph8.0的tris缓冲液、1.5%bsa、5%蔗糖、0.5%peg和0.1%proclin-300。

26、作为一种优化方案，所述检测卡包括上盖、下盖，上盖上设有观察窗和检测孔，检测卡的制备方法包括如下步骤：

27、（1）硝酸纤维素膜的制备：

28、在硝酸纤维素膜上依次包被犬细小病毒抗原、犬瘟热病毒抗原、犬腺病毒抗原和羊抗鼠抗体作为检测t1线、检测t2线和检测t3线和质控c线，犬细小病毒抗原的浓度为0.7mg/ml，犬瘟热病毒抗原的浓度为0.8mg/ml，犬腺病毒抗原的浓度为0.6mg/ml，羊抗鼠抗体的浓度为2mg/ml；

29、（2）吸水垫的制备：

30、将滤纸或卫生纸裁成2*2cm大小的小块，取6块用装订机装订在一起；

31、（3）检测卡的组装

32、先将吸水垫放于下盖的中间位置，然后将裁切好的硝酸纤维素膜放于吸水垫的正中间，将上盖对准硝酸纤维素膜按下密封。

33、作为一种优化方案，一种用于犬病毒抗体三联检的检测试剂盒，还包括样本稀释液，样本稀释液包括20mm pbs、0.2m sds、0.5%吐温、0.1% s21、0.5% bsa和0.1%proclin-300。

34、本发明采取以上技术方案，具有以下优点：

35、1、可同时检测猫瘟病毒、猫杯状病毒、猫疱疹病毒相关抗原的免疫抗体，减少了检测的程序，方便、快速、简捷；

36、2、可以使用全血，不需要昂贵的仪器设备、操作熟练的技术人员、较长的检测时间；

37、3、可常温保存12个月以上，适合在基层推广，不受样本量多少和种类的影响，适用于基层大批量检测，可应用于疫苗免疫效果的评估与检测，对预防和控制病毒的感染具有重要意义；

38、4、标记物是酶或胶体金标spa抗体，应用于渗滤法上比层析法判读结果更快速；

39、5、检测准确率高。

40、下面结合附图和具体实施方式对本发明作进一步说明。