包括使用多核苷酸报道分子和跨膜孔的确定靶分析物的存在或不存在的方法与流程

本发明涉及用于检测分子相互作用例如蛋白质-蛋白质相互作用的新测定法。该方法可用于确定样品中靶分析物的存在、不存在或量。该方法可以以多重形式进行，并且可以用于同时确定多种分析物的存在、不存在或量。该方法可用于筛选靶分析物的结合配偶体。

背景技术：

1、需要能够以高精度检测低浓度分析物的存在的技术，特别是当单个样品中存在多种分析物时。对检测生物标志物以及因此诊断相关疾病或病症的需求特别急迫。

2、跨膜孔(纳米孔)作为直接电子生物传感器具有很大的潜力，用于各种分析物，如聚合物和小分子。当跨纳米孔施加电位时，当如核苷酸或多核苷酸等分子瞬时驻留在纳米孔的桶或通道中一段时间时，电流发生变化。特定分子，如特定核苷酸和特定多核苷酸，给出已知特征和持续时间的电流变化。这种电流变化可以用于识别孔中存在的核苷酸或多核苷酸。包含纳米孔阵列的装置可用于检测和表征多核苷酸，例如以对多核苷酸进行测序。

技术实现思路

1、发明人已经证明，抗体和多核苷酸的组合可以用于基于纳米孔的免疫吸附测定，以确定分析物的存在、不存在或浓度。该测定对于确定一种或多种分析物的存在、不存在或浓度是理想的。该测定可以检测一种靶分析物，或者可以是能够检测一种以上靶分析物的多重测定。

2、更具体地，本发明人已经证明，可以使用固定在表面上的捕获抗体和检测抗体以及多核苷酸报道分子在单重测定中测定靶分析物的浓度。本发明人使用的检测抗体和多核苷酸用生物素功能化，并且链霉抗生物素蛋白用于将多核苷酸报道分子与检测抗体结合，但也可以使用其他连接手段。与检测抗体结合的多核苷酸报道分子的量取决于固定在表面上的分析物的量。通过结合与捕获的分析物结合的检测抗体固定在表面上的多核苷酸报道分子使用跨膜孔直接检测(在从表面释放但没有扩增后)。发明人已经表明，检测到的多核苷酸报道分子的量与表面上捕获的分析物的量成比例。通过使用合适的校准方法，因此可以确定样品中分析物的浓度。

3、发明人还证明，可以在多重测定中确定多于一种靶分析物(即两种或更多种靶分析物)的浓度。在本发明人使用的方法中，捕获每种分析物并用不同的多核苷酸报道分子标记。洗脱并合并结合的多核苷酸报道分子，以用跨膜孔进行检测。使用不同的已知浓度的每种分析物，其中使用不同的多核苷酸报道分子检测每种浓度，以显示该测定可用于同时测定多种分析物的浓度。发现每种分析物的检测灵敏度超过检测和测量分析物在其生理浓度下的浓度所需的灵敏度。在实施例中，测定在测序水平上多路复用。然而，通过使用特异性附着手段(例如将与一种多核苷酸报道分子特异性杂交的不同寡核苷酸(或其多个拷贝)连接到每种检测剂)或通过预组装检测剂/多核苷酸报道分子，可以在单一反应中测定几种分析物。

4、在疾病的诊断和评估中，例如疾病进展的测量或对治疗的响应或确定对治疗的可能响应性，通常需要检测和/或量化至少一种生物标志物，更常见的是两种或更多种生物标志物。发明人已经确定可以使用他们的方法同时量化一组生物标志物。该方法可以容易地执行而无需庞大的设备。例如，该方法可以使用标准免疫测定板(例如elisa板)或珠子进行，并且可以使用包含纳米孔阵列(流动池)的手持装置检测多核苷酸报道分子。

5、该方法允许对于一组中的所有不同生物标志物平衡报道分子读数，即使它们可能在样品(例如血清)中以非常不同的水平存在。敏感蛋白质定量所需的报道分子读数相对较少意味着可以在单个流动池上定量大的生物标志物组，同时使用相同的流动池同时测序外显子组和/或转录组。因此，该方法可用于提供对个体健康状况的综合评估。

6、发明人已经认识到该方法可用于鉴定靶分析物例如药物靶标的结合配偶体。因此，还提供了一种药物筛选方法。

7、因此，提供的是：

8、-一种确定样品中靶分析物存在或不存在的方法，所述方法包括：

9、(a)将所述样品中存在的任何靶分析物固定在表面上；

10、(b)使表面与以下接触：(i)与靶分析物特异性结合的第一检测剂；和(ii)多核苷酸报道分子，其中多核苷酸报道分子与第一检测剂结合着或结合；和

11、(c)使跨膜孔与已固定在表面上的任何多核苷酸报道分子接触，其中通过第一剂与靶分析物的结合将多核苷酸报道分子固定在表面上，并使用跨膜孔检测多核苷酸报道分子，从而确定样品中靶分析物的存在或不存在；

12、-一种确定样品中两种或多种靶分析物存在或不存在的方法，其中使用不同的多核苷酸报道分子检测每种靶分析物，并使用跨膜孔确定多核苷酸报道分子的成分，并且方法步骤如上限定；

13、-一种鉴定靶分析物的结合配偶体的方法，所述方法包括：

14、(a)将靶分析物固定在表面上；

15、(b)使表面与候选结合配偶体和多核苷酸报道分子接触，其中多核苷酸报道分子与候选结合配偶体结合着或结合；和

16、(c)使用跨膜孔检测任何已经固定在表面上的多核苷酸报道分子，其中通过第一剂与靶分析物的结合将多核苷酸报道分子固定在表面上，从而确定候选分子是否是靶分析物的结合配偶体；和

17、-用于检测靶分析物的试剂盒，其包括：

18、(a)(i)与亲和标签的第一组分连接的多核苷酸；

19、(ii)所述亲和标签的第二组分；和

20、(iii)靶分析物的特异性结合剂，其与亲和标签的第二组分连接或包含抗体和所述亲和标签的第一组分；或者

21、(b)(i)多核苷酸；和

22、(ii)靶分析物的特异性结合剂，其与寡核苷酸连接，所述寡核苷酸与多核苷酸的至少一部分杂交；或者

23、(c)(i)靶分析物的特异性结合剂；和

24、(ii)多核苷酸，其中所述多核苷酸与特异性结合剂结合着或能够结合，并且在自由端包含衔接子，该衔接子促进多肽报道分子与所述跨膜孔的相互作用。

技术特征：

1.一种确定样品中靶分析物存在或不存在的方法，所述方法包括：

2.根据权利要求1所述的方法，其包括确定所述样品中所述靶分析物的浓度。

3.根据权利要求1或2所述的方法，其中:

4.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中：

5.根据权利要求4所述的方法，其中：(a)第一检测剂是与所述靶抗体结合的抗体，并且所述捕获剂是所述靶抗体结合的抗原；或者(b)第一检测剂是所述靶抗体结合的抗原，并且所述捕获剂是与所述靶抗体结合的抗体。

6.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中：

7.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中两种或更多种多核苷酸报道分子与第一检测剂结合着或结合，可选地，其中两种或更多种多核苷酸报道分子是相同的。

8.根据前述权利要求中任一项所述的方法，包括确定所述样品中两种或多种靶分析物的存在或不存在，其中使用不同的多核苷酸报道分子检测每种靶分析物，并使用所述跨膜孔确定所述多核苷酸报道分子的成分。

9.根据权利要求8所述的方法，其中所述两种或更多种靶分析物：

10.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中：

11.一种鉴定靶分析物的结合配偶体的方法，所述方法包括：

12.根据权利要求11所述的方法，其中：

13.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中：

14.一种检测靶分析物的试剂盒，包括：

15.根据权利要求14所述的试剂盒，其中:

技术总结
本发明涉及确定样品中靶分析物的存在或不存在的方法。该方法包括将样品中存在的任何靶分析物固定在表面上；使表面与以下接触：(i)与靶分析物特异性结合的第一检测剂；和(ii)多核苷酸报道分子，其中多核苷酸报道分子与第一检测剂结合着或结合；和使跨膜孔与已固定在表面上的任何多核苷酸报道分子接触，其中通过第一剂与靶分析物的结合将多核苷酸报道分子固定在表面上，并使用跨膜孔检测多核苷酸报道分子，从而确定样品中靶分析物的存在或不存在。

技术研发人员：丹尼尔·乔治·福德姆
受保护的技术使用者：牛津纳米孔科技公开有限公司
技术研发日：
技术公布日：2024/1/13