一种区分CAR-T治疗之后CRS重轻症的临床标志物及其应用

本发明涉及生物医药，尤其涉及一种区分car-t治疗之后crs重轻症的临床标志物及其应用。

背景技术：

1、嵌合抗原受体t细胞疗法(chimeric antigen receptor t-cell immunotherapy，car-t)是一种治疗肿瘤的精准靶向疗法，通过基因工程技术，将t细胞激活，并装上定位导航装置car(肿瘤嵌合抗原受体)，专门识别体内肿瘤细胞，并通过免疫作用释放大量的多种效应因子，它们能高效地杀灭肿瘤细胞，从而达到治疗恶性肿瘤的目的。

2、在car-t细胞回输到体内后识别抗原阳性的靶细胞导致t细胞大量活化、增殖，会导致免疫细胞产生大量的炎症因子，从而出现细胞因子释放综合征(cytokine releasesyndrome，crs)。其临床特征表现为发热、低血压和多器官功能障碍等。在car-t治疗之后部分患者会出现不同程度细胞因子释放综合症(crs)，严重时会危及生命。目前区分细胞因子释放综合症(crs)等级的标准有ctcae标准、md anderson癌症中心/lee分级和基于crp的分级等，这些标准根据临床现象以及药物治疗等来判断患者细胞因子释放综合症(crs)严重程度。尽管如此，我们也需要更多的线索来区分重轻症患者从而进行更有效地治疗。

3、cd163是在巨噬细胞上表达的膜受体分子，其作为血红蛋白-触珠蛋白复合物的胞吞受体发挥功能。通过这种在生理学上非常重要的功能，cd163每天摄取约1g的血红蛋白，因此，该蛋白质可能是巨噬细胞上表达最高的受体。因此，通过cd163的表达来判-断细胞因子释放综合症(crs)的严重程度的研究具有广泛的前景。

技术实现思路

1、本发明的目的在于克服现有技术的不足，通过cd163的表达来判-断细胞因子释放综合症(crs)的严重程度从而可以进行有效治疗并且开发新的治疗方法。

2、为了实现本发明的目的，本发明通过以下技术手段实现解决上述技术问题：

3、cd163作为标志物在制备区分嵌合抗原受体t细胞疗法(car-t)治疗之后细胞因子释放综合症(crs)重轻症的方法中使用的试剂盒的用途。

4、本发明首次公开了cd163作为标志物用来区分cat-t治疗之后的细胞因子释放综合症(crs)严重程度，通过血清il6表达和car-t细胞扩增数确认cd163表达和细胞因子释放综合症(crs)严重程度的相关性。

5、优选地，所述cd163作为标志物的方法为测量血清中cd163的表达水平。

6、优选地，测量所述cd163的表达水平的方法包括质谱检测法和平行反应监测法。平行反应监测(prm)是一种基于高分辨、高精度质谱的离子监视技术，能够对目标蛋白质、目标肽段进行选择性检测，从而实现对目标蛋白质/肽段的定量。

7、优选地，所述cd163的表达水平的质谱检测法包括以下步骤：收取car-t治疗前后患者的血清样本，将血清样本经过胰酶消化为肽段后在质谱仪中[q exactive hf-x混合四极-orbitrap或orbitrap exploris 480(thermo fisher)]进行检测；

8、在数据依赖采集(data-dependent acquisition，dda)模式下采集数据，每一个检测循环中优先采集信号相对较强的肽段离子进行碎裂，得到二级谱图，解析二级谱图进行肽段定性分析，对蛋白质进行鉴定；数据依赖采集模式(dda)是基于鸟枪法的原理，在每一个检测循环中优先采集信号相对较强的肽段离子进行碎裂，得到二级谱图，dda数据依赖型扫描模式通常可以鉴定出数千种蛋白质；

9、在质谱仪中dda模式下，质谱原始数据由proteome discoverer(version2.4.0.305，thermo fisher scientific)软件进行搜库从而分析蛋白表达，进而表征血清中cd163的表达。

10、优选地，所述cd163的表达水平的平行反应监测法(parallel reactionmonitoring，prm)包括以下步骤：收取car-t治疗前后患者的血清样本，将血清样本经过胰酶消化为肽段后进行平行反应监测；

11、利用四级杆质量分析器的选择检测能力，在一级质谱中选择性地检测目标肽段的母离子信息；

12、在碰撞池中对母离子进行碎裂，在二级质谱中检测所选择的母离子窗口内的所有碎片的信息，对目标蛋白质/肽段进行准确地特异性分析。

13、具体的，使用nanooflow dionex ultimate 3000rslcnano系统(thermoscientific，san jose，usa)和q exactive hf-x混合四极-orbitrap(thermo fisherscientific，san jose，usa)对多肽进行lc-ms/ms(液相色谱-串联质谱法)分析，液相色谱串联质谱(lc-ms/ms)中，液相色谱负责分离待测物与干扰物，质谱负责检测；样品进样后首先在流动相的携带下进入色谱柱，经过色谱柱分离后进入质谱进行检测，在三重四级杆中一级质谱扫描特定范围离子或允许特定离子进入碰撞室，在碰撞室内分子离子碰撞裂解，形成子离子进入二级质谱，二级质谱扫描特定范围离子或允许特定离子进入检测器，平行反应监测(prm)检测结果导入skyline(maccoss lab，university of washington)，这是一款用于定量数据处理和蛋白质组学分析的开源软件，进行数据分析，在该软件中选择目标蛋白的肽段来表征该蛋白的表达，使用肽段eaefgqgtgpiwlnevk用来量化cd163进而确认cd163表达。

14、细胞因子释放综合症(crs)分级依据美国移植和细胞治疗学会(americansociety for transplantation and cellular therapy，astct，原美国血液和骨髓移植学会)分级标准，进而将crs 1-2级分为轻症，crs 3-5级定为重症。

15、与现有技术相比，本发明的有益效果在于：

16、1、本发明首次公开了cd163作为标志物用来区分cat-t治疗之后的细胞因子释放综合症(crs)严重程度，通过血清il6表达和car-t细胞扩增数确认cd163表达和细胞因子释放综合症(crs)严重程度的相关性。

17、2、本发明通过质谱检测和平行反应监测(prm)验证了car-t治疗之后cd163表达和细胞因子释放综合症(crs)变化趋势一致并且在细胞因子释放综合症(crs)重症患者中表达高于轻症，在炎症最重时的第七天，cd163表达到达峰值并且重轻症差异最明显，这些结果提示cd163在区分细胞因子释放综合症(crs)时是重要的临床指标。

技术特征：

1.cd163作为标志物在制备区分嵌合抗原受体t细胞疗法治疗之后细胞因子释放综合症重轻症的方法中使用的试剂盒的用途。

2.根据权利要求书1所述的应用，其特征在于：所述cd163作为标志物的方法为测量血清中cd163的表达水平。

3.根据权利要求书2所述的应用，其特征在于：测量所述cd163的表达水平的方法包括质谱检测法和平行反应监测法。

4.根据权利要求书3所述的应用，其特征在于，所述cd163的表达水平的质谱检测法包括以下步骤：收取car-t治疗前后患者的血清样本，将血清样本经过胰酶消化为肽段后在质谱仪中进行检测；

5.根据权利要求书3所述的应用，其特征在于，所述cd163的表达水平的平行反应监测法包括以下步骤：收取car-t治疗前后患者的血清样本，将血清样本经过胰酶消化为肽段后进行平行反应监测；

技术总结
本发明公开一种区分CAR‑T治疗之后CRS重轻症的临床标志物及其应用。本发明首次公开了CD163作为标志物用来区分CAT‑T治疗之后的细胞因子释放综合症严重程度，通过质谱检测和平行反应监测(PRM)验证了CAR‑T治疗之后CD163表达和细胞因子释放综合症变化趋势一致并且在细胞因子释放综合症重症患者中表达高于轻症，在炎症最重时的第七天，CD163表达到达峰值并且重轻症差异最明显，这些结果提示CD163在区分细胞因子释放综合症时是重要的临床指标。

技术研发人员：王兴兵,郭天南,王有名,孙瑞
受保护的技术使用者：安徽省立医院（中国科学技术大学附属第一医院）
技术研发日：
技术公布日：2024/1/16