尿液中香草扁桃酸和高香草酸的检测方法及其应用与流程

本发明涉及代谢物检测，尤其是涉及一种尿液中香草扁桃酸和高香草酸的检测方法及其应用。

背景技术：

1、香草扁桃酸(vanillylmandelic acid,vma)，为肾上腺素、去甲肾上腺素的主要终末代谢产物。嗜铬细胞瘤患者能够分泌大量的肾上腺素和去甲肾上腺素，其中大约60％将最终转化为vma，随尿液排出体外。尿中vma含量的升高是临床诊断嗜铬细胞瘤的重要指标。

2、高香草酸(homovanillic acid，hva)与vma结构相似，是体内单胺类神经递质多巴胺的终末代谢产物。神经母细胞瘤患者体内可同时分泌过量的肾上腺素、去甲肾上腺素及多巴胺，其代谢产物vma和hva通过肾脏排泄，在疾病早期即可升高。同时检测尿中vma、hva不仅可以间接反映体内儿茶酚胺的排泌情况，而且对嗜铬细胞瘤、神经母细胞瘤等中枢神经系统疾病的早期诊断及鉴别有重要的意义。

3、香草酸的检测方法主要包括电化学分析法，高效液相色谱法，气相色谱法，均相酶免疫法，胶乳增强免疫比浊法和液相色谱-串联质谱法等。其中以液相色谱-质谱法(lc-ms/ms)测定香草酸的检测结果较佳，能够满足相关法规的灵敏度，特异性和准确度。但是lc-ms/ms法复杂的设备和操作对操作人员有更高的要求，昂贵的设备及维护成本需要更大的资金投入。因此，如何降低香草酸的检测成本，简化检测的操作步骤，同时还能保持检测结果的灵敏度，特异性和准确度是目前有待解决的问题。

4、有鉴于此，特提出本发明。

技术实现思路

1、本发明的目的在于提供一种尿液中香草扁桃酸和高香草酸的检测方法，缓解了现有技术中存在的检测尿液中香草扁桃酸和高香草酸的检测成本高，检测方法复杂的技术问题。

2、为解决上述技术问题，本发明特采用如下技术方案：

3、根据本发明的一个方面，本发明提供了一种尿液中香草扁桃酸和高香草酸的检测方法，包括将经过前处理的待测样本使用高效液相色谱检测，将检测值带入标准曲线中，计算得到尿液样本中香草扁桃酸和高香草酸的含量；

4、所述前处理包括使用含有有机相的萃取液萃取待测样本，将萃取后的待测样本采用高效液相色谱检测。

5、优选地，所述有机相包括正己烷、二氯甲烷或乙酸乙酯；

6、优选地，所述有机相包括乙酸乙酯；

7、优选地，待测样本在萃取前，先使用稀释液稀释，然后加入萃取液萃取，萃取后将分离的有机相氮吹吹干，复溶后采用高效液相色谱检测；

8、优选地，将萃取液与稀释后的待测样本混匀后，旋涡混匀3～10min，然后静置至分层；

9、优选地，所述稀释液包括盐酸水溶液、乙酸水溶液和硼酸水溶液中的任意一种或多种；优选包括盐酸水溶液；

10、优选地，所述稀释液为10～50mmol/l的盐酸水溶液；

11、优选地，氮吹温度为30～70℃，优选为60℃；

12、优选地，采用超纯水复溶经氮吹吹干的待测样本；

13、优选地，待测样本与稀释液的体积比为1：(1～5)，优选为1:3；

14、优选地，待测样本与萃取液的体积比为1：(5～12)，优选为1:10；

15、优选地，取待测样本100μl～300μl进行前处理，优选为100μl。

16、优选地，所述高效液相色谱检测的流动相包括流动相a和流动相b；所述流动相a为水相，所述流动相b为有机相；所述流动相a中含有磷酸二氢钾、乙二胺四乙酸二钠盐和浓磷酸；所述浓磷酸为浓度≥85％的高效液相色谱级磷酸；

17、优选地，所述流动相a中含有15～25mm磷酸二氢钾、0.15～0.25mm乙二胺四乙酸二钠盐和0.001～0.02％v/v浓磷酸；

18、优选地，所述流动相a中含有20mm磷酸二氢钾、0.2mm乙二胺四乙酸二钠盐和0.005％v/v浓磷酸；

19、优选地，所述流动相b为甲醇或乙腈，优选为甲醇。

20、优选地，所述高效液相色谱检测选用pfp色谱柱或c18色谱柱；

21、优选地，所述高效液相色谱检测选用pfp色谱柱；

22、优选地，所述pfp色谱柱选自agilent pursuit pfp色谱柱；

23、优选地，柱温为35～45℃；

24、优选地，柱温为40℃；

25、优选地，所述高效液相色谱检测的洗脱程序为：

26、0.0min，流动相a 90％，流动相b10％；

27、3.5min，流动相a 90％，流动相b10％；

28、5.5min，流动相a 95％，流动相b 5％；

29、15.0min，流动相a 80％，流动相b 20％；

30、15.1min，流动相a 40％，流动相b 60％；

31、17.0min，流动相a 40％，流动相b 60％；

32、17.1min，流动相a 90％，流动相b10％；

33、20.0min，流动相a 90％，流动相b10％。

34、优选地，所述标准曲线为校准品中香草扁桃酸或高香草酸与校准品检测值的对应关系；

35、优选地，以校准品的色谱峰面积为因变量，以校准品中香草扁桃酸或高香草酸的浓度为自变量进行线性回归，得到香草扁桃酸或高香草酸的标准曲线。

36、优选地，所述校准品由系列浓度的若干校准品组成，系列浓度的若干校准品中香草扁桃酸的浓度分布于0.4～80μg/ml，高香草酸的浓度分布于0.6～120μg/ml；

37、优选地，所述检测方法还包括检测质控品；

38、根据本发明的另一个方面，本发明还提供了上述检测方法在制备检测尿液中香草扁桃酸和高香草酸的产品中的应用。

39、与现有技术相比，本发明具有如下有益效果：

40、本发明提供的尿液中香草扁桃酸和高香草酸的检测方法采用液液萃取的方式对待测样本进行前处理，准确度高且前处理成本低，前处理效果比成本更高的固相萃取法准确度更高。本发明对样本分析采用高效液相色谱法，相比于液相色谱-质谱法(lc-ms/ms)测定香草扁桃酸和高香草酸，成本更低，操作更简单，对设备和操作人员的要求均更低，显著的简化了操作程序，降低了检测成本，二十分钟之内即可完成香草扁桃酸及高香草酸的测试，方便，快速，且可实现高通量检测。同时，本发明提供的检测方法仍能满足相关法规对香草扁桃酸及高香草酸检测的线性、重复性、批间差、准确度、稳定性等的要求。该方法香草扁桃酸线性范围0.4-80μg/ml，高香草酸0.6-120μg/ml，相关系数均r≥0.999；低值质控品重复性的变异系数(cv)≤10％，中值质控品重复性的变异系数(cv)≤10％，高值质控品重复性的变异系数(cv)≤10％；准确度的相对偏差(b)≤±15％，加标回收率为85％～115％。

技术特征：

1.一种尿液中香草扁桃酸和高香草酸的检测方法，其特征在于，包括将经过前处理的待测样本使用高效液相色谱检测，将检测值带入标准曲线中，计算得到尿液样本中香草扁桃酸和高香草酸的含量；

2.根据权利要求1所述的检测方法，其特征在于，所述有机相包括正己烷、二氯甲烷或乙酸乙酯；

3.根据权利要求2所述的检测方法，其特征在于，待测样本与稀释液的体积比为1：(1～5)，优选为1:3；

4.根据权利要求1所述的检测方法，其特征在于，所述高效液相色谱检测的流动相包括流动相a和流动相b；所述流动相a为水相，所述流动相b为有机相；所述流动相a中含有磷酸二氢钾、乙二胺四乙酸二钠盐和浓磷酸；所述浓磷酸为浓度≥85％的高效液相色谱级磷酸；

5.根据权利要求1所述的检测方法，其特征在于，所述高效液相色谱检测选用pfp色谱柱或c18色谱柱；

6.根据权利要求1所述的检测方法，其特征在于，所述尿液的来源包括小鼠、大鼠、豚鼠、仓鼠、兔、雪貂、猫、狗、山羊、绵羊、奶牛、猪、马、猴或人，优选为小鼠、大鼠、兔或人。

7.根据权利要求1-6任一项所述的检测方法，其特征在于，所述标准曲线为校准品中香草扁桃酸或高香草酸与校准品检测值的对应关系；

8.根据权利要求7所述的检测方法，其特征在于，所述校准品由系列浓度的若干校准品组成，系列浓度的若干校准品中香草扁桃酸的浓度分布于0.4～80μg/ml，高香草酸的浓度分布于0.6～120μg/ml；

9.根据权利要求1-6任一项所述的检测方法，其特征在于，所述检测方法还包括检测质控品；

10.权利要求1-9任一项所述的检测方法在制备检测尿液中香草扁桃酸和高香草酸的产品中的应用。

技术总结
本发明提供了一种尿液中香草扁桃酸和高香草酸的检测方法及其应用，涉及代谢物检测技术领域。该检测方法包括将经过前处理的待测样本使用高效液相色谱检测，将检测值带入标准曲线中，计算得到尿液样本中香草扁桃酸和高香草酸的含量；前处理包括使用含有有机相的萃取液萃取待测样本；将萃取后的待测样本采用高效液相色谱检测。该检测方法缓解了现有技术中存在的检测尿液中香草扁桃酸和高香草酸的检测成本高，检测方法复杂的技术问题。

技术研发人员：赵炽娜,张新星,栗琳,周立,丁亮,苏营雪,丁沛瑜,郑佳,宋兆晴,张刻
受保护的技术使用者：北京豪思生物科技股份有限公司
技术研发日：
技术公布日：2024/1/13