一种卡那霉素残留检测的比色生物传感方法

一种卡那霉素残留检测的比色生物传感方法，属于现代农业中的兽药残留检测领域。

背景技术：

1、卡那霉素属氨基糖苷类抗生素，在医学、畜牧业和农业中都有广泛的应用。卡那霉素有成本低、水溶性好、具有广谱抗菌作用、对常见的细菌性疾病的治疗效果好等优点，临床上常用其来治疗革兰氏阳性菌和一部分耐药金黄色葡萄球菌属引起的乳腺炎、败血症及泌尿道、呼吸道感染疾病。然而一些养殖户为了提高自身利益常大剂量、不合理使用卡那霉素，导致其残留在肉、蛋、奶制品及其他动物源性食品中，残留抗生素通过食物链进入人体后会造成人耳毒性、肾毒性等毒性作用，并对神经肌肉接头产生阻滞作用，引起过敏反应等，严重时会致人死亡。农业部修订的235公告《动物食品中兽药最高残留限量》对动物性食品中土霉素的残留量做出了严格规定，规定最高残留量不得超过150μg/kg，因此，在国家减抗禁抗的大背景下，实现对动物源食品中卡那霉素的定量检测尤为重要。

2、目前卡那霉素的检测方法已有多种，高效液相色谱法具有分辨率高、分析速度快、重现性高等优点，但前处理过程相对复杂，溶剂需要严格纯化，而且仪器设备相对昂贵。免疫学方法具有操作相对简单、快速、方法易标准化等优点，但同时敏感性相对较低，有类似于靶物质结构的干扰物质存在时，可能出现假阳性现象，测定结果依赖于所用抗体，准确性差。

3、在各种检测技术中，比色生物传感检测方法因为简单、便捷、快速、高效脱颖而出，其对分析仪器的依赖性较小，无需复杂的操作步骤，在现场分析和即时诊断方面具有较大的潜力。随着社会的发展，各种纳米材料开发为比色生物传感器的进一步发展提供了机遇，这将为其在致病病原体、化学品、重金属、食品等领域的检测注入新的血液，对于食品安全、环境卫生及生物医学等领域具有重要的意义。

技术实现思路

1、针对当前检测技术的不足，本发明的目的在于通过构建一种卡那霉素残留检测的比色生物传感方法，实现对卡那霉素残留分析，为动物源食品中兽药残留的快速检测提供技术支撑，抗生素的安全使用提供参考依据。

2、本发明的技术方案为：

3、一种卡那霉素残留检测的比色生物传感方法，包括以下步骤：

4、(1)聚多巴胺载银纳米颗粒的制备

5、将50mg盐酸多巴胺溶解于含200μl 1.25m feso47h2o、0.2m h2o2、25ml tris-buffer和25ml无水乙醇混合并充分溶解，室温避光搅拌40min后离心(10000rpm，10min)冷冻干燥后得到pdans。取2mg pdans超声分散于5ml h2o中，加入1ml 0.278g/ml的柠檬酸钠溶液和新鲜配制的20ml 0.025m的硝酸银溶液，室温下搅拌3h。随后离心(10000rpm，10min)并用超纯水洗涤3次，获得pdans@ag。

6、(2)信号探针spkan的修饰

7、20μl 10μm spkan加入到1ml 2mg/ml的pdans@ag溶液中，37℃振荡孵育12h后，用超纯水离心洗涤三遍，重悬于1ml水中，以获得pdans@ag/spkan。

8、(3)百里香酚酞tp的负载

9、向1ml pdans@ag/spkan溶液中加入400μl 5mm的溶于无水乙醇的tp溶液，37℃搅拌反应2h后，用超纯水离心洗涤3遍，得pdans@ag/tp/spkan。

10、(4)链霉亲和素偶联磁珠mbs表面修饰

11、取10μl mbs于ep管中，用tris-hcl缓冲液洗涤3遍后重悬于50μl 10mm kh2po4缓冲液中备用。20μl 4μm cpkan和20μl 4μm aptkan混合，95℃孵育10min缓慢冷却至室温后得dsdna，将其加入上述mbs中，37℃孵育90min，磁性分离洗涤3次后得到mbs/dsdna。最后加入500μl 2％的bsa溶液对非特异性吸附位点封闭1h。

12、上述的aptkan、cpkan、spkan的序列分别为：

13、aptkan：5’-ag atgggggttgaggctaagccga-3’，

14、cpkan：5’-biotin-atatatatattcgg cttagcctcaacccccatct-3’，

15、spkan：5’-nh2-aaaaaaagatgggggttgaggctaagc-3’。

16、(5)卡那霉素检测

17、向20μl mbs/dsdna溶液中加入20μl卡那霉素溶液和10μl kh2po4缓冲液，37℃孵育1h后，磁性分离洗涤3次得到mbs/cpkan。取200μl pdans@ag/spkan/tp复合物加入到mbs/cpkan中，37℃孵育1.5h，磁性分离洗涤3次后加入200μl ph值为13的碱性naoh溶液显色并测试594nm处吸光度。

技术特征：

1.一种卡那霉素残留检测的比色生物传感方法，其特征是首先在载银聚多巴胺纳米颗粒表面修饰百里香酚酞tp和信号探针spkan形成pdans@ag/tp/spkan作为信号元件，同时将核酸适配体aptkan与互补探针cpkan杂交并修饰在链霉亲和素偶联的磁珠mbs表面形成mbs/dsdna作为识别元件，当卡那霉素kan存在时会与识别元件中的aptkan特异性结合，释放出的cpkan与信号元件中的spkan杂交，实现信号元件在识别元件表面的富集，再加入碱性试剂后，pdans@ag表面负载的tp显色，在594nm处出现特征紫外吸收峰，通过测量不同浓度卡那霉素所对应的紫外-可见吸收光谱值，绘制标准曲线，通过计算即可实现卡那霉素含量的灵敏检测。

2.根据权利要求1所述的一种卡那霉素残留检测的比色生物传感方法，其特征是首先制备载银聚多巴胺纳米颗粒，制备过程是将50mg盐酸多巴胺和含200μl 1.25m feso4·7h2o、0.2m h2o2、25ml tris-buffer和25ml无水乙醇混合并充分溶解，室温避光搅拌40min后10000rpm离心10min后冷冻干燥后得到pdans；取2mg pdans超声分散于5ml h2o中，加入1ml 0.278g/ml柠檬酸钠溶液和20ml 0.025m新鲜配制的硝酸银溶液，室温搅拌3h，随后10000rpm离心10min并用超纯水洗涤3次，获得载银聚多巴胺纳米颗粒。

3.根据权利要求1所述的一种卡那霉素残留检测的比色生物传感方法，其特征是在载银聚多巴胺纳米颗粒表面修饰百里香酚酞tp和信号探针spkan形成pdans@ag/tp/spkan作为信号元件，修饰过程是将20μl 10μm spkan加入到1ml 2mg/ml pdans@ag溶液中，37℃振荡孵育12h后，用超纯水离心洗涤三遍，重悬于1ml超纯水中，以获得pdans@ag/spkan；向其中加入400μl 5mm溶于无水乙醇的tp溶液，37℃振荡孵育2h后，10000rpm离心10min并用超纯水洗涤3次，获得pdans@ag/spkan/tp。

4.根据权利要求1所述的一种卡那霉素残留检测的比色生物传感方法，其特征是将核酸适配体aptkan与互补探针cpkan杂交并修饰在链霉亲和素偶联的磁珠mbs表面形成mbs/dsdna作为识别元件，修饰过程是取10μl mbs于ep管中，用tris-hcl缓冲液洗涤3遍后重悬于50μl10mm kh2po4缓冲液中备用，而后将20μl 4μm cpkan和20μl 4μm aptkan混合，95℃孵育10min缓慢冷却至室温后得dsdna后将其加入上述mbs中，37℃孵育90min，磁性分离洗涤3次后得到mbs/dsdna，最后加入500μl 2％bsa溶液封闭1h。

5.根据权利要求1所述的一种卡那霉素残留检测的比色生物传感方法，其特征是当卡那霉素存在时会与识别元件中的核酸适配体aptkan特异性结合，释放出的互补探针cpkan与信号元件中的spkan杂交，实现信号元件在识别元件表面的富集，实验过程是向20μl mbs/dsdna溶液中加入20μl卡那霉素溶液和10μl kh2po4缓冲液，37℃孵育1h后，磁性分离洗涤3次得到mbs/cpkan；取200μl pdans@ag/spkan/tp复合物加入到mbs/cpkan中，37℃孵育1.5h，磁性分离洗涤3次。

6.根据权利要求1所述的一种卡那霉素残留检测的比色生物传感方法，其特征是向权利要求5中所获得的溶液加入200μl ph值为13碱性naoh溶液，使pdans@ag表面负载的tp显色，测量594nm处吸光度，利用不同浓度卡那霉素对应的吸光度变化，绘制标准曲线，即可实现卡那霉素含量的灵敏检测。

技术总结
一种卡那霉素残留检测的比色生物传感方法，其检测原理为：首先在载银的聚多巴胺纳米颗粒表面修饰百里香酚酞TP和信号探针Sp<subgt;KAN</subgt;形成PDANS@Ag/TP/Sp<subgt;KAN</subgt;作为信号元件，同时将核酸适配体Apt<subgt;KAN</subgt;与互补探针Cp<subgt;KAN</subgt;杂交并修饰在链霉亲和素偶联磁珠MBs表面形成MBs/dsDNA作为识别元件，当卡那霉素存在时会与识别元件中的Apt<subgt;KAN</subgt;特异性结合，释放出的Cp<subgt;KAN</subgt;与信号元件中的Sp<subgt;KAN</subgt;杂交，实现信号元件在识别元件表面的富集，再加入碱性试剂后，PDANS@Ag表面负载的TP显色，在594nm处出现特征紫外吸收峰，通过测量不同浓度卡那霉素所对应的紫外‑可见吸收光谱值，绘制标准曲线，通过计算即可实现卡那霉素含量的灵敏检测，该方法灵敏度高，特异性好，操作便捷，对卡那霉素残留分析具有重要意义。

技术研发人员：许媛媛,苗晋锋,冯世源,胡亚琦
受保护的技术使用者：南京农业大学三亚研究院
技术研发日：
技术公布日：2024/2/25