一步法定量检测CD3/GPRC5D双特异性抗体的方法与流程

本发明属于体内定量药物浓度分析，具体涉及一步法定量检测cd3/gprc5d双特异性抗体的方法。

背景技术：

1、g蛋白偶联受体c5家族亚型d蛋白(g proteincoupled receptor class c group5member d，gprc5d)为7次跨膜受体蛋白，在人体中无已知配体或功能的孤儿受体。gprc5d在原代多发性骨髓瘤细胞表面高表达，在正常组织的表达仅限于免疫赦免性的毛囊区域。此外，gprc5d的过表达与多发性骨髓瘤患者的不良预后和肿瘤负荷有关。gprc5d的过表达与癌症的这种关联使其成为研究多发性骨髓瘤的热门候选靶点。目前，国内外已有企业专注于gprc5d抗体类药物的研制，靶向gprc5d的双特异性抗体cd3×gprc5d已处于ⅱ期临床阶段。因此，找到一种对cd3×gprc5d双特异性抗体进行快速、高效定量检测的方法，有助于推动药物的开发。

2、近年来随着生物技术药物的发展，生物分析技术也迎来越来越多的挑战。目前对于抗体或蛋白类药物，配体结合分析仍然是主要分析手段，但是常规的配体结合分析，比如elisa，实验操作步骤多，且耗时长，完成一个实验，除需要提前包被过夜，完成后续的实验操作还需要5-8个小时；目前市场上也有很多全自动免疫分析仪，但试剂和耗材的成本比较高昂。同时，抗体类药物多为结构域蛋白，与传统小分子药物相比，容易发生聚集，在检测时，若样品中抗体浓度高，易发生聚集而形成二聚体，导致出现非特异性反应，增大背景干扰，从而影响检测效果。并且cd3/gprc5d双特异性抗体为减少cd3毒性反应，在药物设计时降低了其靶点亲和力，因此在完成抗原抗体孵育反应后，结合在msd板子上的结合物，因亲和力较弱易被洗涤液从结合状态洗脱下来，从而降低样本响应。

3、鉴于此，开发一步法快速、高效定量检测cd3/gprc5d双特异性抗体的检测方法具有非常重要的意义。

技术实现思路

1、本发明的目的是提供一步法定量检测cd3/gprc5d双特异性抗体的方法。

2、本发明提供了一种用于定量检测cd3/gprc5d双特异性抗体的稀释液，它是由海藻糖、蔗糖、牛血清白蛋白和pbs缓冲液组成；每1000ml稀释液中含海藻糖10～50g、蔗糖10～50g、牛血清白蛋白10～50g，余量为pbs缓冲液。

3、进一步地，每1000ml稀释液中含海藻糖20g、蔗糖20g、牛血清白蛋白10g，余量为pbs缓冲液。

4、本发明还提供了前述的稀释液用于定量检测cd3/gprc5d双特异性抗体的用途。

5、进一步地，所述定量检测cd3/gprc5d双特异性抗体为定量检测血清中的cd3/gprc5d双特异性抗体。

6、本发明还提供了一步法定量检测cd3/gprc5d双特异性抗体的方法，它包括如下步骤：

7、(1)biotin标记抗cd3抗体；

8、(2)sulfo-tag标记抗gprc5d抗体；

9、(3)用前述的稀释液稀释biotin标记的抗cd3抗体；

10、(4)用前述的稀释液稀释sulfo-tag标记的抗gprc5d抗体；

11、(5)用前述的稀释液稀释待测样品；

12、(6)将步骤(3)、(4)和(5)稀释后的液体混合均匀，孵育后检测待测样品中cd3/gprc5d双特异性抗体的浓度。

13、进一步地，

14、步骤(3)中，用前述的稀释液将biotin标记的抗cd3抗体稀释2000-8000倍；

15、步骤(4)中，用前述的稀释液将sulfo-tag标记的抗gprc5d抗体稀释2000-8000倍；

16、步骤(5)中，用前述的稀释液将待测样品稀释100～200倍。

17、进一步地，

18、步骤(3)中，用前述的稀释液将biotin标记的抗cd3抗体稀释4000倍；

19、步骤(4)中，用前述的稀释液将sulfo-tag标记的抗gprc5d抗体稀释4000倍；

20、步骤(5)中，用前述的稀释液将待测样品稀释100倍。

21、进一步地，步骤(5)中，所述待测样品为血清。

22、进一步地，

23、步骤(6)中，将步骤(3)、(4)和(5)稀释后的液体按体积比1:1:1混合均匀；

24、和/或，所述孵育为室温摇床孵育1～5小时，摇床转速为300～500rpm；

25、和/或，步骤(6)中，所述检测方法为电化学发光法。

26、进一步地，

27、步骤(6)中，采用电化学发光法进行检测时，先在孵育后的溶液中加入readbuffer t；

28、和/或，步骤(6)中，采用电化学发光法进行检测后读取光信号值，采用四参数拟合。

29、与现有技术相比，本发明的优势为：

30、(1)常规夹心法耗时长，其主要步骤首先需要加入捕获抗体，孵育过夜；第二天洗涤后，加入封闭液封闭2小时；封闭完成后取出洗涤，再加入待测样本孵育1小时；然后取出洗涤加入检测抗体孵育1小时，最后取出洗涤加入反应液进行上机检测。而本发明定量检测方法采用一步法，即将捕获抗体、样品和检测抗体一起加入96孔板子中进行孵育1小时；然后取出洗涤后加入反应液进行上机检测，极大缩短了检测时间，提高了样本的检测效率。

31、(2)本发明定量检测方法采用特定稀释液稀释，可以降低背景干扰，阻止结合物被洗脱，从而不影响样本响应。

32、(3)本发明定量检测方法可以转移到其他配体结合平台，比如elisa或clia，只需要将检测抗体的标记由sulfo-tag换成链酶亲和素(hrp)或者鲁米洛，也增加了方法的通用性。

33、综上，本发明提供了一种快速、高效定量检测cd3/gprc5d双特异性抗体的方法，该检测方法采用一步法就可以完成定量检测，极大缩短了检测时间，提高了检测效率；同时，本发明检测方法重现性好，特异性好，检测精密度和准确度高，检测结果稳定可靠，对于定量检测cd3/gprc5d双特异性抗体有良好的应用前景。

34、显然，根据本发明的上述内容，按照本领域的普通技术知识和惯用手段，在不脱离本发明上述基本技术思想前提下，还可以做出其它多种形式的修改、替换或变更。

35、以下通过实施例形式的具体实施方式，对本发明的上述内容再作进一步的详细说明。但不应将此理解为本发明上述主题的范围仅限于以下的实例。凡基于本发明上述内容所实现的技术均属于本发明的范围。

技术特征：

1.一种用于定量检测cd3/gprc5d双特异性抗体的稀释液，其特征在于：它是由海藻糖、蔗糖、牛血清白蛋白和pbs缓冲液组成；每1000ml稀释液中含海藻糖10～50g、蔗糖10～50g、牛血清白蛋白10～50g，余量为pbs缓冲液。

2.根据权利要求1所述的稀释液，其特征在于：每1000ml稀释液中含海藻糖20g、蔗糖20g、牛血清白蛋白10g，余量为pbs缓冲液。

3.权利要求1或2所述的稀释液用于定量检测cd3/gprc5d双特异性抗体的用途。

4.根据权利要求3所述的用途，其特征在于：所述定量检测cd3/gprc5d双特异性抗体为定量检测血清中的cd3/gprc5d双特异性抗体。

5.一步法定量检测cd3/gprc5d双特异性抗体的方法，其特征在于：它包括如下步骤：

6.根据权利要求5所述的方法，其特征在于：

7.根据权利要求6所述的方法，其特征在于：

8.根据权利要求5所述的方法，其特征在于：步骤(5)中，所述待测样品为血清。

9.根据权利要求5所述的方法，其特征在于：

10.根据权利要求9所述的方法，其特征在于：

技术总结
本发明提供了一步法定量检测CD3/GPRC5D双特异性抗体的方法，属于体内定量药物浓度分析技术领域。本发明先提供了一种用于定量检测CD3/GPRC5D双特异性抗体的稀释液，它是由海藻糖、蔗糖、牛血清白蛋白和PBS缓冲液组成；每1000mL稀释液中含海藻糖10～50g、蔗糖10～50g、牛血清白蛋白10～50g，余量为PBS缓冲液。然后利用该稀释液定量检测CD3/GPRC5D双特异性抗体。本发明检测方法采用一步法就可以完成定量检测，极大缩短了检测时间，提高了检测效率；同时，本发明检测方法重现性好，特异性好，检测精密度和准确度高，检测结果稳定可靠，对于定量检测CD3/GPRC5D双特异性抗体有良好的应用前景。

技术研发人员：贺艳琳,岑小波,肖媛媛,吕琳,刘斌,扈正桃,何静,管晓琳,王雪薇
受保护的技术使用者：成都华西海圻医药科技有限公司
技术研发日：
技术公布日：2024/1/13