一种DNA甲基化检测的生物传感器及其制备方法和应用与流程

本发明属于生物检测，具体涉及一种dna甲基化检测的生物传感器及其制备方法和应用。

背景技术：

1、恶性肿瘤是严重危害人类生命健康的一类疾病；随着分子生物学的飞速发展，对于表观遗传学的认知和研究也越来越多，临床上已达到对肿瘤进行基因水平上的诊断及靶向治疗。

2、dna甲基化是指在dna甲基转移酶(dnmt)的催化作用下，以s-腺苷甲硫氨酸(sam)作为甲基供体，将甲基基团结合到胞嘧啶的c-5位，在胞嘧啶-磷酸-鸟嘌呤(cpg)二核苷酸中形成5-甲基胞嘧啶(5-mc)的过程。研究结果表明，dna甲基化与癌症的发生有着密切的关系，在许多癌症中都发现存在dna甲基化异常的现象；因此，dna甲基化的检测对于恶性肿瘤的预测和预后具有重要意义。

3、人体的血浆中存在大量的游离dna(cfdna)，cfdna中通常包含肿瘤细胞坏死或者凋亡后释放的dna；由于检测血浆样本具有容易获取、快速简便且无创伤等优点，通过对血浆cfdna进行甲基化检测以实现恶性肿瘤的早期筛查和诊断具有重要的应用价值。通过电化学方法的dna甲基化检测系统，可以将cfdna甲基化水平的差异转化为电信号，从而可以快速、灵敏地检测dna中的甲基化差异；但是目前的电化学生物传感器检测dna甲基化普遍存在灵敏度低，特异性差的问题。

技术实现思路

1、为了克服现有技术的不足，本发明的目的之一在于提供一种dna甲基化检测的生物传感器的制备方法，可大幅提高生物传感器的灵敏度和特异性。

2、本发明的目的之二在于提供一种dna甲基化检测的生物传感器。

3、本发明的目的之三在于提供一种dna甲基化检测的生物传感器的应用。

4、本发明的目的之一采用如下技术方案实现：

5、一种dna甲基化检测的生物传感器的制备方法，包括以下步骤：

6、s1，将金电极进行镜面打磨后，得到预处理的金电极；

7、s2，将所述预处理的金电极进行活化，清洗并干燥，然后电化学沉积纳米金粒子，得到纳米金修饰的金电极；

8、s3，将所述纳米金修饰的金电极进行表面界面改性后，加入核酸适配体，得到适配体-纳米金修饰金电极；

9、s4，向适配体-纳米金修饰金电极中加入5-mc抗体和电信号复合物，得到dna甲基化检测的生物传感器。

10、进一步地，步骤s1中，具体为，采用粒径为0.01-0.1μm的氧化铝粉将金电极打磨成镜面后，对金电极依次用乙醇和水进行超声清洗，干燥，得到预处理的金电极。

11、进一步地，步骤s2中，将预处理的金电极置于活化液中进行活化，所述活化液为质量比为8-12：1的硫酸和过氧化氢组成的溶液，用纯水清洗并吹干，然后置于haucl4溶液中进行电化学沉积，得到纳米金修饰的金电极。

12、进一步地，步骤s3中，具体操作为，在所述纳米金修饰的金电极表面涂覆界面改性液，40-60℃下处理10-20min后清洗并干燥，然后加入核酸适配体并在3-6℃下孵育10-16h，加入bsa封闭液以封闭金电极表面的空白位点，得到适配体-纳米金修饰金电极。

13、进一步地，界面改性液由质量比为4-6：1的疏水性硫醇和亲水性硫醇组成；所述疏水性硫醇的结构式为hs(ch2)nch3，所述n＝4-8的整数；所述疏水性硫醇的结构式为hs(ch2)noh，所述n＝5-9的整数。

14、进一步地，所述核酸适配体为末端巯基修饰的dna探针。

15、进一步地，步骤s4中，具体操作为，向适配体-纳米金修饰金电极表面滴加5-mc抗体，35-40℃下孵育1-2h，然后滴加可与5-mc抗体结合的电信号复合物孵育0.5-2h，得到dna甲基化检测的生物传感器。

16、进一步地，所述电信号复合物为标记hrp酶、葡萄糖氧化酶、乳酸脱氧酶或青霉素酰化酶的二抗。

17、本发明的目的之二采用如下技术方案实现：

18、一直dna甲基化检测的生物传感器，由所述的dna甲基化检测的生物传感器的制备方法制备而成。

19、本发明的目的之三采用如下技术方案实现：

20、一直dna甲基化检测的生物传感器的应用，所述的dna甲基化检测的生物传感器在制备dna甲基化检测产品中的应用。

21、相比现有技术，本发明的有益效果在于：

22、本发明的一种dna甲基化检测的生物传感器的制备方法，在金电极表面沉积纳米金，可促进电子转移，提高电流强度，同时提高电极的比表面积，有助于核酸适配体的固定，并有利于负载大量的电信号复合物；对金电极进行表面疏水改性能提高对甲基化dna的吸附速率，所述核酸适配体可与靶标dna杂交，实现dna的特异性捕获，并通过金电极实现电信号传递；通过5-mc抗体可与捕获的甲基化dna进行特异性结合，进一步筛选靶标dna，提高特异性，电信号复合物与5-mc抗体结合实现电信号的放大，从而提高检测的灵敏度。

23、本发明的一种dna甲基化检测的生物传感器，可提高甲基化dna检测的灵敏度和特异性，提高检测效率。

技术特征：

1.一种dna甲基化检测的生物传感器的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：

2.如权利要求1所述的dna甲基化检测的生物传感器的制备方法，其特征在于：步骤s1中，具体为，采用粒径为0.01-0.1μm的氧化铝粉将金电极打磨成镜面后，对金电极依次用乙醇和水进行超声清洗，干燥，得到预处理的金电极。

3.如权利要求1所述的dna甲基化检测的生物传感器的制备方法，其特征在于：步骤s2中，将预处理的金电极置于活化液中进行活化，所述活化液为质量比为8-12：1的硫酸和过氧化氢组成的溶液，用纯水清洗并吹干，然后置于haucl4溶液中进行电化学沉积，得到纳米金修饰的金电极。

4.如权利要求1所述的dna甲基化检测的生物传感器的制备方法，其特征在于：步骤s3中，具体操作为，在所述纳米金修饰的金电极表面涂覆界面改性液，40-60℃下处理10-20min后清洗并干燥，然后加入核酸适配体并在3-6℃下孵育10-16h，加入bsa封闭液以封闭金电极表面的空白位点，得到适配体-纳米金修饰金电极。

5.如权利要求4所述的dna甲基化检测的生物传感器的制备方法，其特征在于：界面改性液由质量比为4-6：1的疏水性硫醇和亲水性硫醇组成；所述疏水性硫醇的结构式为hs(ch2)nch3，所述n＝4-8的整数；所述疏水性硫醇的结构式为hs(ch2)noh，所述n＝5-9的整数。

6.如权利要求4所述的dna甲基化检测的生物传感器的制备方法，其特征在于：所述核酸适配体为末端巯基修饰的dna探针。

7.如权利要求1所述的dna甲基化检测的生物传感器的制备方法，其特征在于：步骤s4中，具体操作为，向适配体-纳米金修饰金电极表面滴加5-mc抗体，35-40℃下孵育1-2h，然后滴加可与5-mc抗体结合的电信号复合物孵育0.5-2h，得到dna甲基化检测的生物传感器。

8.如权利要求1或7所述的dna甲基化检测的生物传感器的制备方法，其特征在于：所述电信号复合物为标记hrp酶、葡萄糖氧化酶、乳酸脱氧酶或青霉素酰化酶的二抗。

9.一直dna甲基化检测的生物传感器，其特征在于：由权利要求1-8任一项所述的dna甲基化检测的生物传感器的制备方法制备而成。

10.一直dna甲基化检测的生物传感器的应用，其特征在于：权利要求9所述的dna甲基化检测的生物传感器在制备dna甲基化检测产品中的应用。

技术总结
一种DNA甲基化检测的生物传感器及其制备方法和应用，属于生物检测技术领域；包括以下步骤：S1，将金电极进行镜面打磨后，得到预处理的金电极；S2，将所述预处理的金电极进行活化，清洗并干燥，然后电化学沉积纳米金粒子，得到纳米金修饰的金电极；S3，将所述纳米金修饰的金电极进行表面界面改性后，加入核酸适配体，得到适配体‑纳米金修饰金电极；S4，向适配体‑纳米金修饰金电极中加入5‑mC抗体和电信号复合物，得到DNA甲基化检测的生物传感器。本发明在金电极表面沉积纳米金，可促进电子转移，同时提高电极的比表面积；对金电极进行表面疏水改性能提高对甲基化DNA的吸附速率，从而提高检测的灵敏度。

技术研发人员：钟玙沄,陈斌
受保护的技术使用者：广州尔立简生物科技有限公司
技术研发日：
技术公布日：2024/1/14