一种用于检测血液外泌体中阿尔兹海默病生物标志物的试剂盒及检测生物标志物的方法

本发明涉及生物检测，尤其涉及一种用于检测血液外泌体中阿尔兹海默病生物标志物的试剂盒及检测生物标志物的方法。

背景技术：

1、阿尔茨海默病(ad)是一种隐匿的神经系统退行性疾病，其临床表现为进行性认知功能下降，包括记忆障碍、定向障碍、语言障碍和行为异常，严重影响患者日常生活能力。ad已经被列为继肿瘤、心脏病和脑血管疾病之后引起老年人死亡的第四大病因。目前的临床诊断主要依靠神经心理测试和神经影像学。由于ad生物标志物是用于评估疾病风险的神经化学指标，因此鉴定和检测ad生物标志物对ad很重要。在临床研究中，脑脊液被认为是ad生物标志物的最佳来源。但脑脊液的采集使用的是腰椎穿刺这种侵入性手术，手术风险偏高并且有可能产生副作用。与脑脊液相比，血液测试的简易性和低成本为临床应用和治疗发展开辟了许多令人兴奋的可能性。血液中包含多种蛋白质，肽，脂质和代谢产物，它们反映了包括大脑在内的许多器官的生理活动。其血液外泌体可以作为ad筛查中理想的生物标志物载体。

2、越来越多的研究表明，外泌体参与ad病变的阮病毒样传播。ad中血脑屏障的损伤可能会增加大脑和血液之间生物标志物的双向流动。在此过程中，脑内分泌的外泌体也可以穿过血脑屏障进入外周血。最近的研究发现，血液外泌体中的生物标志物(淀粉样蛋白和磷酸化蛋白)与脑脊液中的生物标志物密切相关。现有的检测方法是利用一些昂贵的商用试剂盒和单分子阵列(simoa)，simoa的检测方法对检测仪器和样本的要求较高，目前临床医院检测的普及性差，多为第三方检测机构辅助检测，仅供研究参考。已知血液外泌体中所含的病理性蛋白水平趋近于常规酶联免疫吸附测定(elisa)检测的下限，这使得准确可靠的生物标志物检测变得困难。因此，开发简易且超灵敏的检测平台可以为ad生物标志物的检测提供一次创新。

3、免疫聚合酶链反应(免疫pcr)是利用抗原抗体反应的特异性和pcr扩增反应的高灵敏性而建立的一种微量抗原检测技术。然而在检测应用中该技术受到许多局限，如非特异性结合导致的高背景等。有研究报道，利用纳米磁珠可以减少非特异性结合。但目前的研究还没有针对ad血液外泌体生物标志物检测的免疫pcr技术。

技术实现思路

1、本发明的目的在于提供一种用于检测血液外泌体中阿尔兹海默病生物标志物的试剂盒及检测生物标志物的方法，利用本发明试剂盒可以实现对血液外泌体标志物的高精度及高灵敏度的检测，操作简便，具有较高的临床应用价值。

2、为了实现上述发明目的，本发明提供以下技术方案：

3、本发明提供了一种用于检测血液外泌体中阿尔兹海默病生物标志物的试剂盒，包括抗cd63抗体、磁珠、目标生物标志物的抗体-dna寡核苷酸偶联物、qpcr核酸扩增试剂。

4、优选的，所述抗cd63抗体为生物素偶联的抗cd63抗体。

5、优选的，所述磁珠为抗生物素超顺磁性磁珠。

6、优选的，所述目标生物标志物抗体包括抗aβ1-42抗体、抗aβ1-40抗体、抗p-tau396,404抗体和抗p-tau181抗体中的一种或几种。

7、优选的，所述dna寡核苷酸为巯基修饰的dna寡核苷酸；

8、优选的，所述dna寡核苷酸的序列如seq id no.1或seq id no.4所示。

9、优选的，所述目标生物标志物的抗体-dna寡核苷酸偶联物的制备方法为：

10、将纯化后的目标生物标志物的抗体和dna寡核苷酸以摩尔比为1:5～1:15的比例混合，0～5℃孵育10～15h。

11、本发明还提供了一种非诊断目的利用上述任一项所述试剂盒检测阿尔兹海默病生物标志物的方法，包括以下步骤：

12、(1)血液中外泌体的富集；

13、(2)将步骤(1)富集的外泌体与目标生物标志物的抗体-dna寡核苷酸偶联物结合，得到磁珠-外泌体@抗体-dna复合物，然后进行qpcr，即可对血液外泌体中生物标志物进行检测。

14、优选的，步骤(1)中所述富集的方法包括以下步骤：

15、将血液与抗cd63抗体混合，再加入磁珠，得到磁珠-外泌体复合物。

16、优选的，步骤(2)中所述进行qpcr前，还包括以下步骤：

17、将磁珠-外泌体@抗体-dna复合物用1×pbs洗涤1～5次，在磁珠沉淀物中加入洗脱缓冲液孵育5～15min，进行磁性分离，上清液用于qpcr检测。

18、相比于现有技术，本发明的有益效果为：

19、(1)血液外泌体的提取采用外泌体膜蛋白的抗原抗体与磁珠相结合的特点，具有特异性好、富集能力高的优势，所富集的外泌体形态均一。通过这一手段富集外泌体，简化了传统外泌体提取的操作步骤，且节约血液样本。

20、(2)利用磁珠提取外泌体进行免疫pcr可以减少清洗和孵育步骤，并减少非特异性结合。

21、(3)巯基修饰的dna寡核苷酸可以与对应标志物的抗体结合，用于后续检测。

22、(4)免疫pcr通过将抗原抗体作用与pcr的灵敏度相结合，利用pcr扩增信号放大，对目标生物标志物的检测灵敏度更高，所需仪器普遍，操作简便，适合广泛推广应用。利用不同的dna寡核苷酸可以实现同一样品中多种生物标志物的同时检测。

技术特征：

1.一种用于检测血液外泌体中阿尔兹海默病生物标志物的试剂盒，其特征在于，包括抗cd63抗体、磁珠、目标生物标志物的抗体-dna寡核苷酸偶联物、qpcr核酸扩增试剂。

2.根据权利要求1所述的试剂盒，其特征在于，所述抗cd63抗体为生物素偶联的抗cd63抗体。

3.根据权利要求1所述的试剂盒，其特征在于，所述磁珠为抗生物素超顺磁性磁珠。

4.根据权利要求1所述的试剂盒，其特征在于，所述目标生物标志物抗体包括抗aβ1-42抗体、抗aβ1-40抗体、抗p-tau396,404抗体和抗p-tau181抗体中的一种或几种。

5.根据权利要求1所述的试剂盒，其特征在于，所述dna寡核苷酸为巯基修饰的dna寡核苷酸；

6.根据权利要求4或5所述的试剂盒，其特征在于，所述目标生物标志物的抗体-dna寡核苷酸偶联物的制备方法为：

7.一种非诊断目的利用权利要求1～6任一项所述试剂盒检测阿尔兹海默病生物标志物的方法，其特征在于，包括以下步骤：

8.根据权利要求7所述的方法，其特征在于，步骤(1)中所述富集的方法包括以下步骤：

9.根据权利要求7所述的方法，其特征在于，步骤(2)中所述进行qpcr前，还包括以下步骤：

技术总结
本发明属于生物检测技术领域，提供了一种用于检测血液外泌体中阿尔兹海默病生物标志物的试剂盒及检测生物标志物的方法，所述用于检测阿尔兹海默病生物标志物的试剂盒包括抗CD63抗体、磁珠、目标生物标志物的抗体‑DNA寡核苷酸偶联物、qPCR核酸扩增试剂。本发明利用上述试剂盒，通过将抗原抗体识别与PCR的灵敏度相结合创建一种免疫PCR方法，在纳米磁珠消除高背景的辅助下，可检测到的血液外泌体生物标志物浓度低至10fg/mL。利用本发明公开的方法可以实现对血液外泌体标志物的高精度及高灵敏度的检测，操作简便，具有较高的临床应用价值。

技术研发人员：骆海明,胡顺
受保护的技术使用者：华中科技大学
技术研发日：
技术公布日：2024/1/13