一种检测烯酰吗啉的时间分辨荧光试纸条及其应用的制作方法

本发明涉及时间分辨荧光免疫层析快速检测，具体为一种检测烯酰吗啉的时间分辨荧光试纸条及其应用。

背景技术：

1、烯酰吗啉是一种新型内吸治疗性专用低毒杀菌剂，其作用机制是破坏病菌细胞壁膜的形成；属专一防治卵菌纲真菌性病害药剂，对霜霉病、霜疫霉病、晚疫病、疫(霉)病、疫腐病、腐霉病、黑胫病等低等真菌性病害均具有很好的防治效果。在实际应用中，烯酰吗啉常被超范围用于防治菠萝、草莓、马铃薯等作物的霜霉病和疫病。gb2763-2021《食品安全国家标准食品中农药最大残留限量》规定了烯酰吗啉的最大残留限量：菠萝为0.01mg/kg；马铃薯、草莓均为0.05mg/kg等。

2、现有检测烯酰吗啉的方法有气相色谱-质谱联用法(gc-ms)、高效液相色谱法(hplc)、酶联免疫吸附试验(elisa)，尽管仪器检测方法精密度较高，但这些方法所需要的仪器价格昂贵和检测人员的专业性要求严格，检测步骤复杂，难以大批量快速的检测，也不利于检测技术在日常生活上的推广。免疫层析技术是一种快捷、便利且不需要专业技能的检测技术，检测人员仅需通过简单辨别分析就可得出结果，基于aunps的免疫层析试纸条是目前被广泛使用的检测试纸条，但其能达到的灵敏度较低，不能满足实际的检测要求，因此，为了提高灵敏度并能达到定量的结果，研发一种基于时间分辨荧光纳米微球的烯酰吗啉快速定量检测试纸条，该方法简便快速又能准确定量。

技术实现思路

1、本发明要解决的技术问题是克服现有的缺陷，提供一种灵敏度高、操作简单、检测时间短、成本低的烯酰吗啉时间分辨荧光试纸条，可以有效解决背景技术中的问题。

2、本发明的第一个目的是提供一种烯酰吗啉时间分辨荧光试纸条，该试纸条包括卡壳和试纸条主体，试纸条主体由pvc底板、nc膜(硝酸纤维素膜)、吸水垫、金标垫以及样品垫组成。nc膜位于底板中间，吸水垫位于nc膜的一侧，金标垫和样品垫搭接在nc膜的另外一侧；

3、其中，所述nc膜上设有检测线(t线)和质控线(c线)，t线上包被烯酰吗啉抗原，c线上包被羊抗鼠二抗；所述金标垫经过处理后并携带烯酰吗啉单克隆抗体-时间分辨荧光微球标记物；所述样品垫经过处理后得到。

4、作为本发明的一种优选技术方案，所述nc膜为硝酸纤维素膜，是c/t线的承载体，也是免疫反应的反应处。

5、作为本发明的一种优选技术方案，所述nc膜上，t线包被的是烯酰吗啉抗原，浓度为0.1～1.0mg/ml，c线包被的是羊抗鼠二抗，浓度为0.05～0.8mg/ml。

6、作为本发明的一种优选技术方案，所述金标垫经过处理后所得，处理方法为：将金标垫放入含有4％蔗糖、1％海藻糖和0.2％吐温-20的处理液中充分侵润，侵润后取出并干燥，即处理完成。

7、作为本发明的一种优选技术方案，所述时间分辨荧光微球为填充了镧系元素离子螯合物的荧光微球，该镧系元素离子螯合物为铕(eu)元素，该荧光微球的粒径为200～600nm。

8、作为本发明的一种优选技术方案，所述烯酰吗啉单克隆抗体-时间分辨荧光微球标记物是时间分辨荧光微球所标记的烯酰吗啉单克隆抗体，是通过荧光微球和烯酰吗啉抗体偶联结合所得。

9、作为本发明的一种优选技术方案，所述样品垫经过处理后所得，处理方法为：将样品垫放入含有1％ bsa、0.1％ pvp、0.8％ nacl、和1％吐温-20的处理液中充分侵润，侵润后取出并干燥，即处理完成。

10、本发明的第二个目的是为了提供一种制备上述试纸条的方法，主要步骤包括：

11、(1)样品垫处理制备：将未处理样品垫(玻璃纤维素膜sf-06)放置样品垫处理液中侵润，然后取出干燥保存备用。

12、(2)烯酰吗啉单克隆抗体-时间分辨荧光微球标记物制备：采用时间分辨荧光微球和烯酰吗啉抗体偶联所得。

13、(3)金标垫处理制备及喷涂烯酰吗啉单克隆抗体-时间分辨荧光微球标记物：将未处理金标垫(聚酯纤维素膜mao120)放置金标垫处理液中侵润，然后取出干燥，再将烯酰吗啉单克隆抗体-时间分辨荧光微球标记物均匀喷涂于处理干燥后的金标垫上。

14、(4)nc膜喷涂烯酰吗啉抗原及羊抗鼠二抗：nc膜贴于底板中间，将烯酰吗啉抗原及羊抗鼠二抗分别稀释至0.1～1.0mg/ml、0.05～0.8mg/ml，并均匀喷涂于nc膜的t/c线上，干燥保存备用。

15、(5)吸水垫干燥保存备用。

16、(6)试纸条主体组装：将吸水垫贴于底板的一侧，置于nc膜的上方，重叠1～2mm；将金标垫和样品垫搭接(样品垫在金标垫上方)贴于底板的另一侧，置于nc膜的上方，重叠1～2mm。

17、(7)试纸条制备：将上述试纸条主体干燥、切条，置于卡壳中。

18、本发明的第三个目的是为了提供一种应用上述试纸条检测菠萝、草莓、马铃薯等样品中烯酰吗啉残留含量的方法，其步骤包括：

19、(1)绘制标准曲线：将烯酰吗啉的标准品用0.02m，ph＝7的pbs溶液配制成一系列不同浓度的烯酰吗啉标准品溶液；将不同浓度的烯酰吗啉标准品溶液加入到试纸条样品垫上，37℃恒温层析反应，结束后用荧光免疫分析仪读出t/c比值，将浓度为0.00ng/m的t/c比值设定为t0，将其他浓度的t/c比值设定为t；以烯酰吗啉标准品溶液浓度的对数值为横坐标，t/t0×100(％)比值为纵坐标，进行标准曲线绘制，得到烯酰吗啉相应的标准曲线。

20、(2)样品前处理方法：检测前将样本剪成细碎小丁，用0.1m，ph＝7的pbs溶液进行样品提取，得到样品溶液。

21、(3)试纸条对样品进行检测：取样品溶液加入到试纸条的样品垫上，使其在37℃下恒温层析反应十分钟，反应结束用荧光免疫分析仪读出t/c比值。

22、(4)检测结果分析：将测出的t/c比值带入步骤(1)的标准曲线中，即得到待测样本中烯酰吗啉的浓度，即定量结果。

23、与现有技术相比，本发明的有益效果是：本检测烯酰吗啉的时间分辨荧光试纸条采用高特异性的抗体抗原反应及免疫层析技术，样品中的烯酰吗啉在流动过程中和固定于金标垫上的烯酰吗啉单克隆抗体-时间分辨荧光微球标记物结合，检测线(t线)上的烯酰吗啉抗原与样品中的烯酰吗啉相互竞争结合烯酰吗啉单克隆抗体-时间分辨荧光微球标记物，从而影响检测线(t线)的荧光强度发生改变，最终应用荧光免疫分析仪计算出样品液中含有的烯酰吗啉残留量。

24、本发明的试纸条具有灵敏度高、特异性强、操作简单、定量检测、成本低、测试时间短、适合各种人群使用的优点；用本发明的试纸条检测烯酰吗啉残留的方法简便、快速、准确、适用范围广、成本低、易推广使用。

技术特征：

1.一种检测烯酰吗啉的时间分辨荧光试纸条，其特征在于：该试纸条包括卡壳和试纸条主体，试纸条主体由pvc底板、nc膜(硝酸纤维素膜)、吸水垫、金标垫以及样品垫组成，nc膜位于底板中间，吸水垫位于nc膜的一侧，金标垫和样品垫搭接在nc膜的另外一侧；

2.根据权利要求1所述的一种检测烯酰吗啉的时间分辨荧光试纸条及其应用，其特征在于：所述nc膜为硝酸纤维素膜，是c/t线的承载体，也是免疫反应的反应处。

3.根据权利要求1所述的一种检测烯酰吗啉的时间分辨荧光试纸条及其应用，其特征在于：所述nc膜上，t线包被的是烯酰吗啉抗原，浓度为0.1～1.0mg/ml，c线包被的是羊抗鼠二抗，浓度为0.05～0.8mg/ml。

4.根据权利要求1所述的一种检测烯酰吗啉的时间分辨荧光试纸条及其应用，其特征在于：所述金标垫的处理方法为：将金标垫放入含有4％蔗糖、1％海藻糖和0.2％吐温-20的处理液中充分侵润，侵润后取出并干燥，即处理完成。

5.根据权利要求1所述的一种检测烯酰吗啉的时间分辨荧光试纸条及其应用，其特征在于：所述时间分辨荧光微球为填充了镧系元素离子螯合物的荧光微球，该镧系元素离子螯合物为铕(eu)元素，该荧光微球的粒径为200～600nm。

6.根据权利要求1所述的一种检测烯酰吗啉的时间分辨荧光试纸条及其应用，其特征在于：所述烯酰吗啉单克隆抗体-时间分辨荧光微球标记物是时间分辨荧光微球所标记的烯酰吗啉单克隆抗体，是通过荧光微球和烯酰吗啉抗体偶联结合所得。

7.根据权利要求1所述的一种检测烯酰吗啉的时间分辨荧光试纸条及其应用，其特征在于：所述样品垫的处理方法为：将样品垫放入含有1％bsa、0.1％pvp、0.8％nacl、和1％吐温-20的处理液中充分侵润，侵润后取出并干燥，即处理完成。

8.一种制备检测烯酰吗啉的时间分辨荧光试纸条的方法，其特征在于，主要步骤包括：

9.一种应用检测烯酰吗啉的时间分辨荧光试纸条检测菠萝、草莓、马铃薯样品中烯酰吗啉残留含量的方法，其特征在于，主要步骤包括：

技术总结
本发明公开了一种烯酰吗啉时间分辨荧光试纸条，该试纸条包括卡壳和试纸条主体，试纸条主体由PVC底板、NC膜、吸水垫、金标垫以及样品垫组成，NC膜位于底板中间，吸水垫位于NC膜的一侧，金标垫和样品垫搭接在NC膜的另外一侧，本检测烯酰吗啉的时间分辨荧光试纸条采用高特异性的抗体抗原反应及免疫层析技术，样品中的烯酰吗啉在流动过程中和固定于金标垫上的烯酰吗啉单克隆抗体‑时间分辨荧光微球标记物结合，检测线(T线)上的烯酰吗啉抗原与样品中的烯酰吗啉相互竞争结合烯酰吗啉单克隆抗体‑时间分辨荧光微球标记物，从而影响检测线(T线)的荧光强度发生改变，最终应用荧光免疫分析仪计算出样品液中含有的烯酰吗啉残留量。

技术研发人员：杨梅,蒲小容,陈顶,杨成淑,陈丽,吴辉,令狐克勇,何国书
受保护的技术使用者：贵州国芯生物科技有限公司
技术研发日：
技术公布日：2024/1/14