生物组织参照切片、生物标志物的检测方法及应用与流程

本发明涉及化学检测领域，特别涉及一种生物组织参照切片及其应用，利用该组织切片的生物标志物的检测方法及其试剂盒和检测系统。

背景技术：

1、各类肿瘤的发生和发展过程都有一定的代谢产物产生，肿瘤代谢组的变化大多是由于基因突变造成的，因此针对肿瘤代谢产物和基因突变的检测可以有效地预判肿瘤发展过程并协助肿瘤分期，对进一步采取有效治疗手段、改善预后具有指导意义，但是现有检测方法操作复杂、检测周期长，无法快速响应临床需求。基因突变常见检测手段主要有基因测序(sanger)、免疫组织化学法(ihc)，定量聚合酶链反应(qpcr)等，这些方法通常劳动密集、样品等预处理复杂，需要熟练掌握核酸提取、pcr操作等复杂精巧的实验技能；另外，这些方法耗时长，通常完成单次实验时长在4小时以上，尤其是临床上多采用的ihc和sanger方法出具最终报告要1天左右。对肿瘤代谢产物的定性和定量检测有多种方法，如利用气质或液质联用系统(gc/lc-ms)、磁共振光谱(mrs)、解析电喷雾离子色谱(desi-ms)、快速蒸发电离质谱(rei-ms)等手段检测。这些色谱或质谱检测方法结果准确可靠，但是同样需要复杂且耗时的前处理过程和样品组分分离过程。

2、而且，上述方法都是针对肿瘤患者的血清样本或者肿瘤组织的细胞破碎样本进行检测，无法实现肿瘤组织的原位检测。

技术实现思路

1、本发明旨在至少在一定程度上解决现有技术中存在的技术问题至少之一。为此，本发明提供了生物组织参照切片及其用途，以及检测生物组织中生物标志物的方法、试剂盒和检测系统，利用该生物组织参照切片和方法可实现生物标志物的原位定量检测，检测结果准确、检测周期短、样品预处理操作简单，临床应用价值高。

2、需要声明的是，本发明是基于发明人的下列工作而完成的：

3、基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱(maldi-tof-ms)是一种软电离生物质谱，其原理是用激光照射基质与样品分子形成的共结晶，基质从激光中吸收能量并传递给生物分子，使生物分子解吸并离子化，从而实现电离的过程。maldi-tof-ms由于其特有的软电离方式离子源，特别适用于检测蛋白、多肽、脂质等生物大分子，目前在生命科学、医学等领域应用越来越广泛。其中，maldi-tof-ms成像图是将当次检测样本中信号强度最高的扫描点的生物分子的丰度赋值100％，其他扫描点根据其检测信号强度的高低进行不同丰度赋值，最终在maldi-tof-ms成像图中，不同空间生物分子丰度显示不同的颜色。

4、发明人尝试利用maldi-tof-ms对非小细胞肺癌(nsclc)的肿瘤标志物琥珀酸进行检测发现：a)对非小细胞肺癌组织切片样本的琥珀酸分子进行扫描得到的成像图，只能反应琥珀酸分子含量的相对高低，不能体现样本中琥珀酸分子的具体含量或浓度；b)同时，基于maldi-tof-ms成像图原理，不同批次样本maldi-tof-ms成像图琥珀酸丰度赋值100％的扫描点的信号强度高低不同，导致不同次或不同样本的成像图，其数据无可比性。因此，无法通过maldi-tof-ms实现nsclc组织切片样本中琥珀酸的原位定量检测。

5、进一步地，发明人创造性地在maldi-tof-ms检测过程中，设置了含有琥珀酸标准品的肺组织切片，既是琥珀酸含量对照，又是琥珀酸在肺组织中空间分布的浓度对照。在具体的试验中，发明人创造性地将琥珀酸的标准品溶液与健康的肺组织切片接触，并发现琥珀酸可进一步分布至切片组织中，进而得到了含有琥珀酸标准品的肺组织切片。发明人通过控制标准品的量及其与组织切片的接触区域，可在一个肺组织切片中形成多个分布有琥珀酸的区域，这些区域空间内琥珀酸的总含量及其在单位体积肺组织中的含量确定。

6、进一步的试验结果表明，通过在maldi-tof-ms质谱检测中设置上述含有标准品的生物组织切片作为对照，可实现生物组织中生物标志物的原位定量检测；同时质谱检测样本预处理操作简单、耗时短。

7、在本发明的一个方面，本发明提出了一种生物组织参照切片。所述参照切片包含：标准品，所述标准品分布于所述生物组织切片的至少部分区域，所述标准品含有生物标志物，所述生物标志物用于鉴定所述生物组织的生理状态。本发明的生物组织参照切片可作为阳性对照，用于生物标志物的检测，为生物组织的生理生化状态的预判提供参考。

8、在本发明的另一个方面，本发明提出了上述生物组织参照切片在检测待测生物组织中所述生物标志物中的应用。上述生物组织参照切片可进一步用于检测待测生物组织中所述生物标志物的含量，所述检测可以是定性的，也可以是定量的，还可以是原位检测。本发明的应用为生物组织生物标志物的检测提供了多种可选方案，提高了检测方法的选择度。

9、在本发明的再一方面，本发明提出了一种生物组织中生物标志物的检测方法。本发明的检测方法可实现生物组织中标志物的检测，尤其是生物组织生物标志物的原位定量检测，并且检测结果准确、检测周期短，检测结果可为生物组织的生理生化状态的预判提供参考，尤其为肿瘤的发生发展阶段的预测提供有效参考并协助肿瘤浸润程度、肿瘤分期、肿瘤转移程度的预判等，有助于进一步采取有效治疗手段、改善预后，具有良好的临床价值。

10、在本发明的再一方面，本发明提出了一种试剂盒。本发明的试剂盒用于生物组织生物标志物的检测，可降低操作复杂性，进一步缩短检测时长，利于本发明的生物组织切片和生物标志物的检测方法在化学检测领域的广泛应用。

11、在本发明的最后一方面，本发明提出了一种检测系统。本发明的检测系统可实现生物组织中生物标志物检测的全流程控制。

12、本发明的附加方面和优点将在下面的描述中部分给出，部分将从下面的描述中变得明显，或通过本发明的实践了解到。

技术特征：

1.一种生物组织参照切片，其特征在于，包含：标准品，所述标准品分布于所述生物组织切片的至少部分区域，所述标准品含有生物标志物，所述生物标志物用于鉴定所述生物组织的生理状态。

2.根据权利要求1所述的切片，其特征在于，所述生物组织来源于健康个体；

3.权利要求1～2任一所述的生物组织参照切片在检测待测生物组织中所述生物标志物中的应用；

4.一种检测生物组织中生物标志物的方法，其特征在于，

5.根据权利要求4所述的方法，其特征在于，基于质谱峰图和质谱成像图，确定所述待测生物组织切片中的生物标志物的含量是通过如下方式实现的：

6.根据权利要求4或5所述的方法，其特征在于，所述质谱峰图和质谱成像图通过所述生物标志物的内标质谱峰质量校准后得到；

7.根据权利要求4～6任一所述的方法，其特征在于，所述生物组织是肿瘤组织，所述生物标志物是肿瘤标志物；

8.一种试剂盒，其特征在于，

9.一种检测系统，其特征在于，所述系统包括权利要求1～2任一所述的生物组织参照切片，或权利要求8所述的试剂盒，或所述系统的运行基于权利要求4～7任一所述的方法；

技术总结
本发明提供生物组织参照切片及其用途，以及检测生物组织中生物标志物的方法、试剂盒和检测系统。所述参照切片包含：标准品，所述标准品分布于所述生物组织切片的至少部分区域，所述标准品含有生物标志物，所述生物标志物用于鉴定所述生物组织的生理状态。所述方法利用MALDI‑TOF‑MS质谱分别对待测生物组织切片和上述生物组织参照切片进行检测，获得待测生物组织切片和生物组织参照切片的质谱峰图和质谱成像图；基于质谱峰图和质谱成像图，确定所述待测生物组织切片中的生物标志物的含量。利用本发明的生物组织参照切片和方法可实现生物标志物的原位定量检测，检测结果准确、检测周期短、样品预处理操作简单，临床应用价值高。

技术研发人员：张晨曦,佟雪梅
受保护的技术使用者：融智生物科技（青岛）有限公司
技术研发日：
技术公布日：2024/1/14