一种携带VEGF外泌体检测试剂盒及应用的制作方法

本发明属于生物，具体的为一种携带vegf外泌体检测试剂盒制备及应用。

背景技术：

1、血管内皮生长因子(vascular endothelial growth factor，vegf)，是胚胎发育、骨骼生长和生殖功能中血管生成的重要调节因子，与肿瘤、眼内新生血管疾病和其他疾病相关的病理性血管生成有关。

2、1939年，ide等假设肿瘤来源的血管生长刺激因子的存在，可能为生长中的肿瘤提供新的血管供应。

3、1968年的实验表明肿瘤血管生成是由肿瘤细胞产生的扩散因子介导的。

4、1971年，folkman提出抗血管生成可能是治疗癌症的一种有效的治疗策略。在过去的二十年中，血管内皮生长因子(vegf)在生理和病理血管生成的调节中的关键作用已经确立。

5、人类vegf-a基因由7个内含子分隔开的8个外显子组成。

6、外显子经信号序列切割后，会产生不同的亚型(如vegf-121，vegf-165，vegf-189，vegf-206，分别含有121,165,189和206个氨基酸)。

7、vegf-121是一种不结合肝素的酸性多肽，是一种自由扩散蛋白。vegf-189和vegf-206是高度碱性的，几乎完全隔离在细胞外基质(ecm)中，与肝素结合亲和力高。

8、天然vegf的特性与vegf-165密切对应，具有中间属性，经分泌产生但有相当一部分仍然与细胞表面和ecm结合，与ecm结合的异构体可通过c端纤溶酶裂解以扩散形式释放，产生生物活性片段。

9、肝素结合域的丧失导致vegf有丝分裂活性的显著丧失。

10、研究表明vegf-165具有最佳的生物利用度和生物效价特性。

11、vegf是肿瘤中血管生成的关键介质，在癌基因表达、多种生长因子和缺氧条件下均可上调vegf的表达。

12、血管生成对癌症的发展和生长至关重要：在肿瘤生长超过1-2mm之前，需要血管提供营养和氧气。

13、肿瘤导致的vegf和其他生长因子异常表达导致“血管生成开关”形成，进而在肿瘤内部和周围形成新的血管系统，使其以指数级增长。

14、vegf作用下形成的肿瘤血管在结构和功能上均异常：血管形状不规则，弯曲，有死角，不形成小静脉、小动脉和毛细血管。

15、它们还会渗漏和出血，导致高间质压。

16、这些特征意味着肿瘤血流不佳，导致缺氧和进一步产生vegf。

17、vegf在肿瘤血管生成中的核心作用使其成为抗肿瘤治疗的合理靶点。

18、研究表明携带vegf的外泌体可能对早期肿瘤血管生成至关重要。

19、外泌体可以通过激活90kda vegf(vegf90k)来诱导mda-mb-231细胞的血管生成。

20、研究还发现，hsp90在外泌体vegf附近定位，降低了bevacizumab的效率。

21、这些数据表明，vegf激活的hsp90可以提高肿瘤细胞的生存能力。

22、胰腺癌(pc)衍生的外泌体可以通过触发人类脐静脉内皮细胞(huvec)中的基因表达来推动血管生成。

23、huvec中p-akt和p-erk1/2的高水平证明了pc衍生外泌体的血管生成功能。

24、总而言之，这些研究表明，外泌体蛋白与血管生成和血管通透性相关，从而促进癌症进展。

技术实现思路

1、技术问题：

2、常规血清中vegf，受到血氧因素、结合蛋白等影响，导致血清vegf和疾病相关性较差。

3、外泌体是由各种细胞自然分泌的，通常在体液中检测到，包括血液、尿液、腹水和唾液。肿瘤衍生(td)外泌体由肿瘤细胞释放，并携带能反映亲代肿瘤细胞特征的物质。

4、携带vegf的外泌体可能对早期肿瘤血管生成至关重要。

5、目前尚没有，监测携带vegf特征外泌体的监测试剂的开发。

6、技术方案：

7、为解决上述问题，本申请文件的公开内容提供了一种携带vegf外泌体试剂盒的制备方法携带vegf外泌体检测方法。

8、试剂盒包含独立的组分包括外泌体捕获工作液、携带vegf外泌体检测工作液、阴性质控品和阳性质控品。

9、为了实现上述目的，本申请提供如下技术方案：

10、1.cd63单重链重组人源化抗体制备。

11、2.vegf单重链重组人源化抗体制备。

12、外泌体捕获工作液的制备。

13、携带vegf外泌体检测工作液制备。

14、携带vegf外泌体检测试剂盒制备。

15、携带vegf外泌体检测方法。

16、携带vegf外泌体检测试剂盒性能评价。

技术特征：

1.一种携带vegf外泌体检测试剂盒，其特征在于可也检测携带vegf的外泌体及方法，进一步的携带vegf外泌体检测试剂盒包含独立的组分为：外泌体捕获工作液、携带vegf外泌体检测工作液、阴性质控品和阳性质控品。

2.如权利1中所述的外泌体捕获工作液，其特征在于通过包被磁性微球的捕获抗体制备；进一步的所述的磁性微球其特征在于超顺磁性，粒径可从50nm-5μm；进一步的所述的捕获抗体其特征在于可以结合外泌体膜表面蛋白、跨膜蛋白和吸附蛋白等的哺乳动物源抗体。如权利1中所述的携带vegf外泌体检测工作液，其特征在于通过发光物质标记vegf抗体制备；进一步的所述的发光物质其特征在于可为化学物质激发发光、电致发光、荧光以及其聚合物；进一步的所述的vegf抗体其特征在于可以结合vegf蛋白的哺乳动物源抗体。如权利1中所述的阴性质控品，其特征在于其人源细胞产生的外泌体和工程化的人源的外泌体。如权利1中所述的阳性质控品，其特征在于人源细胞产生的外泌体和工程化的人源的外泌体。如权利1中所述的其特征在于可也检测携带vegf的外泌体及方法，其特征在于通过免疫双夹心的原理检测方法，进一步的所述的免疫双夹心方法其特征在于可为酶联免疫吸附法、免疫荧光法、化学发光免疫分析法、电化学发光免疫分析法、微流控芯片免疫分析法、蛋白液相芯片法、数字酶联免疫吸附法和单分子免疫分析法等。

3.如权利2中所述的进一步的所述的磁性微球其特征在于超顺磁性，粒径可从50nm-5μm，其特征在于粒径可从50nm-5μm其中优选的为3μm。如权利2中所述的进一步的所述的捕获抗体其特征在于可以结合外泌体膜表面蛋白、跨膜蛋白和吸附蛋白等的哺乳动物源抗体，其特征在于所述的可以结合外泌体膜表面蛋白、跨膜蛋白和吸附蛋白可为hsp60、hsp70、hspa5、cct2、hsp90、a33、mhc-ii、cd86、cd63、cd9、cd81、tsg101、hsp70、alix等其中优选的cd63。如权利2中所述的进一步的所述的捕获抗体其特征在于可以结合外泌体膜表面蛋白、跨膜蛋白和吸附蛋白等的哺乳动物源抗体，其特征在于所述的哺乳动物源抗体，可为基因重组人源化类、猴类、啮齿类和反刍类等其中优选的为基因重组人源化的，进一步优选的其特征为cd63单重链重组人源化抗体，通过使用cd63重组蛋白免疫动物获得重链可变区序列，并构建至表达载体，转染受体细胞获得。如权利要求2中所述的如权利1中所述的携带vegf外泌体检测工作液，其特征在于通过发光物质标记vegf抗体制备；进一步的所述的发光物质其特征在于可为化学物质激发发光、电致发光、荧光以及其聚合物，其特征在于其中所述的化学发光物质为吖啶酯以及其衍生物，进一步优选的为吖啶酯聚合物。如权利要求2中所述的如权利1中所述的进一步的所述的vegf抗体其特征在于可以结合vegf蛋白的哺乳动物源抗体，其特征在于所述的可以结合vegf蛋白的哺乳动物源抗体中的vegf蛋白可为vegf提取纯化蛋白和基因重组蛋白，进一步的所述的vegf重组蛋白可为全长、vegf-121，vegf-165，vegf-189，vegf-206部分肽段，进一步的其中优选的为vegf165重组蛋白。如权利要求2中所述的进一步的所述的vegf抗体其特征在于可以结合vegf蛋白的哺乳动物源抗体，其特征在于其特征在于所述的哺乳动物源抗体，可为基因重组人源化类、猴类、啮齿类和反刍类等其中优选的为基因重组人源化的，进一步优选的其特征为vegf单重链重组人源化抗体，通过使用vegf165重组蛋白免疫动物获得重链可变区序列，并构建至表达载体，转染受体细胞获得。如权利2中所述的权利1中所述的阴性质控品，其特征在于其人源细胞产生的外泌体和工程化的人源的外泌体，其中所述的其特征在于人源细胞产生的外泌体和工程化的人源细胞的外泌体其中的人源细胞可为人源的原代细胞和永生化细胞，进一步的优化的为hek293细胞来源的外泌体。如权利2中所述的权利1中所述的阳性质控品，其特征在于其人源细胞产生的外泌体和工程化的人源的外泌体，其中所述的其特征在于人源细胞产生的外泌体和工程化的人源细胞的外泌体其中的人源细胞可为人源的原代细胞和永生化细胞，进一步的优化的为hek293细胞来源的外泌体。如权利2所述的进一步的所述的免疫双夹心方法其特征在于可为酶联免疫吸附法、免疫荧光法、化学发光免疫分析法、电化学发光免疫分析法、微流控芯片免疫分析法、蛋白液相芯片法、数字酶联免疫吸附法和单分子免疫分析法等，进一步优选的为化学发光免疫分析法，进一步的其特征为全自动化学发光免疫分析检测方法。

4.如权利3中所述的其中优选的cd63蛋白和权利3中所述的通过使用cd63重组蛋白免疫动物获得重链可变区序列，其中所述的cd63其特征在于可为该蛋白全长和（1-11）11个氨基酸的胞内段、（33-51）的胞外段、（103-202 ）101个氨基酸的胞外段和（225-238 ）14个氨基端胞内段等部分肽段，进一步的优选的为（103-202 ）101个氨基酸的胞外段。

5.如权利3中所述的并构建至表达载体，转染受体细胞获得，其中所述的可为原核表达载体和真核表达载体，其特征在于进一步的优选的为真核表达载体pxc17.4；其中所述的转染受体细胞，其特征在于进一步的优选的为hek293细胞。

6.如权利3中所述的进一步优选的为化学发光免疫分析法，进一步的其特征为全自动化学发光免疫分析检测方法，其中所述的全自动化学发光免疫分析检测方法其特征在于检测前将受试样本平衡至室温18°c~26°c，扫描试剂盒二维码，将试剂盒放入分析仪器的试剂位，上机测试阴性质控品和阳性质控品，分析仪器自动将受试样品50ul、外泌体捕获工作液100ul和携带vegf外泌体检测工作液100ul依次加入反应杯中，37°c孵育15分钟，分析仪自动磁分离外泌体复合物后，加入洗液300ul，清洗三次，加入激发液a和激发液b各100ul至反应杯，光电倍增管读取发光值。

技术总结
本申请文件中的公开内容涉及一种携带VEGF外泌体检测试剂盒制备及应用，更具体而言，涉及该试剂盒的制备方法，以及检测方法的应用。血管内皮生长因子（vascular endothelial growth factor，VEGF），是胚胎发育、骨骼生长和生殖功能中血管生成的重要调节因子，与肿瘤、眼内新生血管疾病和其他疾病相关的病理性血管生成有关。研究表明携带VEGF的外泌体可能对早期肿瘤血管生成至关重要。外泌体可以通过激活90 kDa VEGF（VEGF90K）来诱导MDA‑MB‑231细胞的血管生成。VEGF激活的Hsp90可以提高肿瘤细胞的生存能力。目前尚没有，监测携带VEGF特征外泌体的监测试剂的开发。本发明通过以下技术方案的实施实现了携带VEGF外泌体的检测。

技术研发人员：刘芳朋,荣义辉,庞晓丛,王丽娟,李晓露,游波,杨景华,李军,刘莲娜,苗鸿鹰
受保护的技术使用者：曙歌制药科技（北京）有限公司
技术研发日：
技术公布日：2024/1/15