一种肾穿刺组织IV型胶原表达的检测方法与流程

本发明属于肾脏病理检测，具体涉及一种肾穿刺组织iv型胶原表达的检测方法。

背景技术：

1、iv型肝原(collagen type iv，简写为civ)是由分子交联形成的一种网状结构，是肝基底膜的主要成分，存在于肝门静脉血管区，中央静脉周围，沿着窦状隙分布。iv型肝原在合成代谢过程中不需去除端肽而沉积于细胞外基质，故血中iv型肝原的含量升高可能反映了肝血窦基底膜的更新率加快。基础和临床研究均发现血清iv型肝原水平和肝纤维化及门脉高压程度密切相关，与肝脏炎症活动关系较小。因此，测定血清中iv型胶原含量是辅助诊断肝纤维化的一个重要指标。除了对肝纤维化进行辅助诊断，血清iv型肝原是判断糖尿病早期肾损害或肾小球纤维化程度的有用指标，肾小球基底膜中大部分iv型胶原蛋白是α3、α4和α5链交织形成。

2、alport综合征是由于编码ⅳ型胶原α3/α4/α5链的基因突变导致的遗传性肾脏疾病，临床上表现为血尿、蛋白尿及进行性肾衰竭，部分患者合并耳聋和眼部改变。主要表现为持续性肾小球性血尿或血尿伴蛋白尿的患者，当检测到肾小球基底膜(gbm)iv型胶原a3、a4、a5链免疫荧光染色异常即可确诊alport综合征，因此检测ⅳ型胶原a3、a4、a5链的荧光染色情况能够为诊断alport综合征提供重要依据。

3、石蜡包埋组织的免疫荧光染色技术，在基础研究以及临床病理诊断中仍发挥着重要的作用。尤其是在多重标记物的定位、膜抗原的鉴定、抗体的类型(荧光标记抗体)、微量蛋白质的定位以及肾穿刺组织活检的病理诊断中具有非常重要的地位。但是，组织经过福尔马林固定后，在固定的过程中ca2+和其他二价离子与蛋白质所形成的紧密复合物，封闭了抗原，导致在石蜡切片上进行免疫荧光染色时，抗原抗体的结合受阻，直接影响染色结果的特异性和敏感性，导致影响检测结果的准确性和检出率。因此，目前ⅳ型胶原表达检测几乎不用石蜡切片作为检测物。

4、目前ⅳ型胶原染色常规用冰冻切片组织做免疫荧光的染色，以检测ⅳ型胶原的表达情况，由于取材及分割因素的影响，并不是所有的肾穿刺组织都有肾小球，在冰冻切片无肾小球的情况下，便无法观察免疫荧光iv型胶原的表达情况。

技术实现思路

1、基于此，本发明的目的在于提供一种肾穿刺组织iv型胶原表达的检测方法，该方法能够提高肾穿刺组织iv型胶原表达情况的准确性和检出率。

2、实现上述目的包括如下技术方案。

3、本发明第一方面提供一种肾穿刺组织iv型胶原表达的检测方法，包括如下步骤：

4、将肾穿刺组织石蜡切片脱蜡水化处理后得到处理后的组织切片；

5、将处理后的组织切片加入修复液中，加热煮沸后冷却至室温得到修复后的组织切片；

6、将修复后的组织切片加入蛋白酶进行酶解，得到酶解后的组织切片；

7、在酶解后的组织切片中滴加一抗抗体进行初步孵育，随后加入荧光素标记的针对一抗抗体的二抗抗体进行孵育得到。

8、在其中一些实施例中，加热煮沸时间为4.5mim～5.5min；优选地，加热煮沸时间为4.8mim～5.2min。

9、在其中一些实施例中，酶解时间为2min～3min，蛋白酶的浓度为120ug/ml～130ug/ml；优选地，酶解时间为2.5min～3min，蛋白酶的浓度为123ug/ml～127ug/ml。

10、在其中一些实施例中，所述蛋白酶为胃蛋白酶。

11、在其中一些实施例中，所述修复液为edta缓冲液，且所述edta缓冲液的ph值为8～9。

12、在其中一些实施例中，所述荧光素为异硫氰酸荧光素。

13、在其中一些实施例中，在处理后的组织切片加入修复液之前，还包括如下步骤：

14、将修复液预热至90℃～99℃。

15、在其中一些实施例中，所述肾穿刺组织石蜡切片的厚度为1.3μm～1.7μm。

16、在其中一些实施例中，将修复后的组织切片加入蛋白酶进行酶解的步骤包括：

17、将修复后的组织切片用磷酸盐缓冲液清洗；

18、清洗后将湿润状态的组织切片加入蛋白酶进行酶解操作；

19、酶解完成后的组织切片用磷酸盐缓冲液清洗。

20、在其中一些实施例中，在将修复后的组织切片用磷酸盐缓冲液清洗的步骤之前，还包括用免疫组画笔在修复后的组织切片的四周画圈形成闭合环圈，所述闭合环圈将所述组织切片围合于内。

21、本发明中，发明人选择了肾穿刺组织石蜡切片作为检测载体，利用免疫荧光技术检测肾穿刺组织iv型胶原表达的过程中，通过将肾穿刺组织石蜡切片经脱蜡后进行高温修复结合蛋白酶消化，经过合适的处理，发现经过严格的控制工艺后，能够使iv型胶原上的α3、α4和α5链充分显示，能够在抗体荧光检测过程中使得iv型胶原的α3、α4和α5链与抗体充分结合，提高染色结构的特异性、准确性和敏感性，对有肾小球或无肾小球的肾穿刺组织中的iv型胶原表达情况均能够准确检测，有效提高肾穿刺组织免疫荧光iv型胶原检出率。在此过程中，通过优化高温修复的时长、蛋白酶消化的时长以及蛋白酶的浓度，能够使iv型胶原表达的荧光表达效果更优。因此，该肾穿刺组织iv型胶原表达的检测方法适用于肾穿刺组织无肾小球或肾小球过少无法检测iv型胶原的表达情况，特异性强，能够为肾穿刺组织无肾小球的情况下检测alport综合征提供一种新的检测方法。

技术特征：

1.一种肾穿刺组织iv型胶原表达的检测方法，其特征在于，包括如下步骤：

2.如权利要求1所述的检测方法，其特征在于，加热煮沸时间为4.5mim～5.5min；优选地，加热煮沸时间为4.8mim～5.2min。

3.如权利要求1或2所述的检测方法，其特征在于，酶解时间为2min～3min，蛋白酶的浓度为120ug/ml～130ug/ml；优选地，酶解时间为2.5min～3min，蛋白酶的浓度为123ug/ml～127ug/ml。

4.如权利要求1至3任一项所述的检测方法，其特征在于，所述蛋白酶为胃蛋白酶。

5.如权利要求1至3任一项所述的检测方法，其特征在于，所述修复液为edta缓冲液，且所述edta缓冲液的ph值为8～9。

6.如权利要求1至3任一项所述的检测方法，其特征在于，所述荧光素为异硫氰酸荧光素。

7.如权利要求1至3任一项所述的检测方法，其特征在于，在处理后的组织切片加入修复液之前，还包括如下步骤：

8.如权利要求1至3任一项所述的检测方法，其特征在于，所述肾穿刺组织石蜡切片的厚度为1.3μm～1.7μm。

9.如权利要求1至3任一项所述的检测方法，其特征在于，将修复后的组织切片加入蛋白酶进行酶解的步骤包括：

10.如权利要求9所述的检测方法，其特征在于，在将修复后的组织切片用磷酸盐缓冲液清洗的步骤之前，还包括用免疫组画笔在修复后的组织切片的四周画圈形成闭合环圈，所述闭合环圈将所述组织切片围合于内。

技术总结
本发明属于肾脏病理检测技术领域，公开了一种肾穿刺组织IV型胶原表达的检测方法，包括如下步骤：将肾穿刺组织石蜡切片脱蜡水化处理后得到处理后的组织切片；将处理后的组织切片加入修复液中，加热煮沸后冷却至室温得到修复后的组织切片；将修复后的组织切片加入蛋白酶进行酶解得到酶解后的组织切片；在酶解后的组织切片中滴加一抗抗体进行初步孵育，随后加入荧光素标记的针对一抗抗体的二抗抗体进行孵育得到。该肾穿刺组织IV型胶原表达的检测方法适用于肾穿刺组织无肾小球或肾小球过少无法检测IV型胶原的表达情况，特异性强，能够为肾穿刺组织无肾小球的情况下检测Alport综合征提供一种新的检测方法。

技术研发人员：候玲玲,耿丹,杨光,宣瑞红,杨苗,赵利伟
受保护的技术使用者：太原金域临床检验所有限公司
技术研发日：
技术公布日：2024/1/14