基于UPLC指纹图谱和含量测定的石上柏质量控制方法

本发明涉及一种基于uplc指纹图谱和含量测定的石上柏质量控制方法。

背景技术：

1、石上柏（ selaginella doederleiniihieron.）属于蕨类植物门卷柏科卷柏属植物深绿卷柏的全草，为多年生草本植物，又名大叶菜、地侧柏等[1]。在我国贵州、四川、广东、广西等地分布较多。该药味甘带涩，性温平，具有抗癌止血、清热解毒、祛风除湿等功效，临床上主要用于治疗咽喉肿痛、风湿痹痛、鼻咽癌、绒毛膜上皮癌、肺癌、宫颈癌等多种疾病，同时对多种感染性炎症，特别对上呼吸道、急性扁桃腺炎、肺炎等效果显著[2，3]。

2、现代化学成分研究表明，石上柏主要含双黄酮类、生物碱类、甾醇、皂苷、氨基酸等成分。在卷柏属药用植物的化学成分研究中最有意义的是双黄酮类化学成分的发现，目前已从深绿卷柏中分离得到8种黄酮[4-7]。其中穗花杉双黄酮、穗花杉双黄酮、罗波斯塔双黄酮、白果双黄酮、扁柏双黄酮、橡胶树双黄酮5种双黄酮具有良好的生物活性[8-12]。

3、蒋咏梅等[13]采用高效液相色谱法（high performance liquid chromatography，hplc）测定了3种双黄酮的含量，黄建勇等[14]采用hplc法同时测定穗花杉双黄酮、罗伯斯塔双黄酮、2"，3"-二氢-3'，3‴-双芹菜素及3'，3‴-双袖皮素。基于5种双黄酮具有较好的抗肿瘤作用，是石上柏的有效成分，且经查阅目前无采用uplc法同时测定石上柏中5种双黄酮含量的文献。

技术实现思路

1、本发明所要解决的是应用uplc法建立了同时测定穗花杉双黄酮、罗波斯塔双黄酮、白果双黄酮、扁柏双黄酮、橡胶树双黄酮5个主要活性成分的含量分析方法，并成功将其应用到石上柏药材活性成分含量分析的技术问题。

2、为了解决上述技术问题，本发明采用如下技术方案：

3、基于uplc指纹图谱和含量测定的石上柏质量控制方法，包括如下步骤：

4、步骤一，供试品溶液的制备；

5、将石上柏经干燥后粉碎机进行粉碎，过中国药典60目筛，分别精确称量不同产地的石上柏5.0g，采用75%乙醇溶液回流提取3次，过滤，合并，浓缩，再经乙酸乙酯萃取，旋转蒸发仪浓缩得乙酸乙酯萃取物，用甲醇溶解定容，即得；

6、步骤二，测定法：吸取供试品溶液，注入超高效液相色谱仪中，按色谱柱：ascentis-c18(250mm×4.6mm，5µm)；流动相：乙腈(a)，0.1%甲酸水溶液(b)；检测波长：330nm；柱温：25℃；流速：0.5ml/min；进样量：2μl的色谱条件进行测定记录得石上柏的指纹指纹图谱；

7、再将所得指纹指纹图谱数据导入《中药色谱指纹图谱相似度评价系统（2012版）》，采用中位数法，时间窗设为0.1min，经多点校正后，进行mark峰匹配，系统生成石上柏药材的色谱叠加图和对照指纹图谱。

8、本发明首次建立uplc法同时测定13批中草药石上柏5种双黄酮成分（穗花杉双黄酮、罗波斯塔双黄酮、白果双黄酮、扁柏双黄酮、橡胶树双黄酮）的含量，并作了精密度、重复性、稳定性及加样回收率方面的考察。方法学考察结果表明，其各项评价指标的相对标准偏差均<2.0%，表明在该色谱条件下，仪器精密度良好，样品在24h内稳定性良好，适用于石上柏中5种双黄酮的含量测定。含量测定结果表明，5种双黄酮在石上柏中的含量分布呈现一定的规律性，即穗花杉双黄酮>罗波斯塔双黄酮>扁柏双黄酮>橡胶树双黄酮>白果双黄酮。结合主成分分析可从多角度综合判断石上柏双黄酮的质量。石上柏不同产地间5种双黄酮的含量有一定差异，可能与不同地域、不同采收时间以及不同的加工方法有关。该方法操作简便，测定准确，可用于中药石上柏的质量分析。

技术特征：

1.基于uplc指纹图谱和含量测定的石上柏质量控制方法，其特征在于：它包括如下测定方法：

2.根据权利要求1所述的质量控制方法，其特征在于：采用超高效液相色谱仪，该方法中用乙腈-0.1%甲酸水梯度洗脱作为流动相。

技术总结
基于UPLC指纹图谱的石上柏质量控制方法，包括如下步骤：将石上柏经干燥后粉碎机进行粉碎，过中国药典60目筛，分别精确称量不同产地的石上柏5.0g，采用75%乙醇溶液回流提取3次，过滤，合并，浓缩，再经乙酸乙酯萃取，旋转蒸发仪浓缩得乙酸乙酯萃取物，用甲醇溶解定容，即得；吸取供试品溶液，注入超高效液相色谱仪中，按色谱柱：Ascentis‑C18(250mm×4.6mm，5µm)；流动相：乙腈(A)，0.1%甲酸水溶液(B)；检测波长：330nm；柱温：25℃；流速：0.5mL/min；进样量：2μL的色谱条件进行测定记录得石上柏的指纹指纹图谱；再将所得指纹指纹图谱数据导入图谱相似度评价系统，采用中位数法，时间窗设为0.1min，经多点校正后，进行Mark峰匹配，系统生成石上柏药材的色谱叠加图和对照指纹图谱。

技术研发人员：王刚,宋玉,代明俊,万小青,黄春凤,蒋永梅,刘超,谯磊
受保护的技术使用者：遵义医科大学
技术研发日：
技术公布日：2024/1/14