一种胰蛋白酶活性检测试剂和活性检测方法与流程

本发明属于蛋白酶活性检测，具体地说，涉及一种胰蛋白酶活性检测试剂和活性检测方法。

背景技术：

1、目前，根据药典中的胰酶活性检测方法，胰蛋白酶的活性检测是借助于胰蛋白酶特异性底物nα-对甲苯磺酰-l-精氨酸甲酯盐酸盐(以下简写为tame·hcl)或n-苯甲酰-l-精氨酸乙酯盐酸盐(以下简写为baee·hcl)中的酯键被胰蛋白酶水解断裂，生成物在特定的波长下有吸收峰，通过单位时间内吸光度的增加量进行计算得到胰蛋白酶的活性。而生物试验过程中，tame或baee水解产生的氨基酸类衍生物会导致溶液的ph发生变化，在遇绝大多数细胞培养基中的指示剂时或溶液中存在其他成分受ph影响时，会影响吸光度的检测，从而影响检测结果的准确性。因此现有的方法只能用于常规提取物的胰酶活性检测。

技术实现思路

1、本申请的发明人通过研究发现，胰蛋白酶水解酯类底物(本发明采用的是tame·hcl或baee·hcl)，生成氨基酸类衍生物与碳酸氢钠发生中和反应，造成溶液中的ph变化，通过紫外可见分光光度计在特定波长下显示出来，通过计算单位时间内的吸光度变化，与单位活性的胰蛋白酶造成的吸光度变化进行对比，计算出胰蛋白酶的活性。因此，本发明的第一个目的在于提供一种胰蛋白酶活性检测试剂。本发明的第二个目的在于提供一种相较广泛应用的胰蛋白酶活性检测方法，该方法不仅可以应用于常规提取物的胰蛋白酶活性检测，也可以在含ph指示剂的溶液中进行检测，以解决常规的胰蛋白酶活性检测方法引起溶液中的ph变化后，在某些情况下出现检测不准确的问题。

2、为实现上述目的，本发明采用以下技术方案：

3、作为本发明的第一个方面，一种胰蛋白酶活性检测试剂，包括如下组分：苯酚红、胰蛋白酶特异性底物和弱碱试剂；

4、所述胰蛋白酶特异性底物为tame·hcl或baee·hcl。

5、根据本发明，所述弱碱试剂为不与酯键发生反应的弱碱试剂。

6、优选地，所述弱碱试剂为碳酸氢钠或碳酸氢钾。

7、根据本发明，所述苯酚红的浓度为0.1-0.4g/l，所述胰蛋白酶特异性底物的浓度为20mmol/l±10％，所述弱碱试剂的浓度为1mol/l±10％。

8、优选地，所述苯酚红的浓度为0.2g/l，所述胰蛋白酶特异性底物的浓度为20mmol/l，所述弱碱试剂的浓度为1mol/l。

9、根据本发明，所述苯酚红、特异性底物、弱碱试剂三者的体积比为苯酚红:特异性底物:弱碱试剂＝1-5:30-80:3-10。

10、作为本发明的第二个方面，一种胰蛋白酶活性检测方法，包括如下步骤：

11、(1)胰蛋白酶活性检测试剂的制备：

12、分别配制特定浓度的苯酚红、胰蛋白酶特异性底物、以及弱碱试剂的溶液，溶解完全后按照比例混合制成胰蛋白酶活性检测试剂；

13、(2)预处理：

14、将紫外可见分光光度计开机预热，调节波长至550nm-560nm，用纯化水调零；

15、(3)参比溶液的检测：

16、用检测试剂对参比溶液进行检测，计算平均吸光度变化值，记为δ0；

17、(4)标准品的配制及检测：

18、准确称量配制单位质量的新鲜胰蛋白酶标准品溶液并进行稀释，稀释后的浓度记为c标；用检测试剂对标准品溶液进行检测，计算平均吸光度变化值，记为δ标；

19、(5)待测组分的胰蛋白酶活性检测：

20、将待测组分进行稀释，稀释后浓度记为c样；用检测试剂对待测组分进行检测，计算平均吸光度变化值，记为δ样；

21、(6)胰蛋白酶活性检测结果的计算：

22、u样＝u标*活性比值，其中，标准品的活性记为u标，活性比值＝[(δ样-δ0)*稀释倍数/c样]/[(δ标-δ0)*稀释倍数/c标]*100％。

23、根据本发明，所述步骤(2)中紫外可见分光光度计的波长为557nm。

24、根据本发明，所述步骤(4)中将标准品稀释至≤0.05g/l；所述步骤(5)中将待测组分稀释至≤0.05g/l。

25、具体地，所述步骤(3)中对参比溶液进行检测的操作为：将检测试剂与参比溶液按照1:1的体积比快速混匀加入比色皿中，吸光度开始稳定降低时，连续检测并记录至少5min内的吸光度变化，求平均每分钟的吸光度变化值，记为δ0；

26、所述步骤(4)中对标准品进行检测的操作为：将检测试剂与稀释后的标准品溶液按照1:1的体积比快速混匀后加入比色皿中，吸光度开始稳定降低时，连续检测并记录至少5min内的吸光度变化，求平均值，记为δ标；

27、所述步骤(5)中对待测组分进行检测的操作为：将检测试剂与待检组分按照1:1的体积比快速混匀加入比色皿中，吸光度开始稳定降低时，连续检测并记录至少5min内的吸光度变化，求平均值，记为δ样。

28、进一步地，所述步骤(3)中对参比溶液进行检测的操作为：将检测试剂与参比溶液按照1:1的体积比快速混匀加入比色皿中，吸光度开始稳定降低时，连续检测并记录8min内的吸光度变化，求平均每分钟的吸光度变化值，记为δ0；

29、所述步骤(4)中对标准品进行检测的操作为：将检测试剂与稀释后的标准品溶液按照1:1的体积比快速混匀后加入比色皿中，吸光度开始稳定降低时，连续检测并记录8min内的吸光度变化，求平均值，记为δ标；

30、所述步骤(5)中对待测组分进行检测的操作为：将检测试剂与待检组分按照1:1的体积比快速混匀加入比色皿中，吸光度开始稳定降低时，连续检测并记录8min内的吸光度变化，求平均值，记为δ样。

31、本发明的胰蛋白酶活性检测试剂和活性检测方法，其有益效果是：不仅可以应用于常规提取物的胰蛋白酶活性检测，也可以在含ph指示剂的溶液中进行检测，以解决常规的胰蛋白酶活性检测方法引起溶液中的ph变化后，在某些情况下出现检测不准确的问题。且该种活性检测方法的检测准确度也较高。除此之外，该试剂盒还能够在活性已知的情况下计算胰蛋白酶的浓度。

技术特征：

1.一种胰蛋白酶活性检测试剂，其特征在于，包括如下组分：苯酚红、胰蛋白酶特异性底物和弱碱试剂；

2.如权利要求1所述的胰蛋白酶活性检测试剂，其特征在于，所述弱碱试剂为不与酯键发生反应的弱碱试剂。

3.如权利要求2所述的胰蛋白酶活性检测试剂，其特征在于，所述弱碱试剂为碳酸氢钠或碳酸氢钾。

4.如权利要求1-3任一项所述的胰蛋白酶活性检测试剂，其特征在于，所述苯酚红的浓度为0.1-0.4g/l，所述胰蛋白酶特异性底物的浓度为20mmol/l±10％，所述弱碱试剂的浓度为1mol/l±10％。

5.如权利要求4所述的胰蛋白酶活性检测试剂，其特征在于，所述苯酚红的浓度为0.2g/l，所述胰蛋白酶特异性底物的浓度为20mmol/l，所述弱碱试剂的浓度为1mol/l。

6.如权利要求4所述的胰蛋白酶活性检测试剂，其特征在于，所述苯酚红、特异性底物、弱碱试剂三者的体积比为苯酚红:特异性底物:弱碱试剂＝1-5:30-80:3-10。

7.一种胰蛋白酶活性检测方法，其特征在于，包括如下步骤：

8.如权利要求7所述的胰蛋白酶活性检测方法，其特征在于，所述步骤(2)中紫外可见分光光度计的波长为557nm。

9.如权利要求7所述的胰蛋白酶活性检测方法，其特征在于，所述步骤(4)中将标准品稀释至≤0.05g/l；所述步骤(5)中将待测组分稀释至≤0.05g/l。

10.如权利要求7所述的胰蛋白酶活性检测方法，其特征在于，所述步骤(3)中对参比溶液进行检测的操作为：将检测试剂与参比溶液按照1:1的体积比快速混匀加入比色皿中，吸光度开始稳定降低时，连续检测并记录至少5min内的吸光度变化，求平均每分钟的吸光度变化值，记为δ0；

技术总结
本发明提出了一种胰蛋白酶活性检测试剂，包括苯酚红、胰蛋白酶特异性底物和弱碱试剂；所述胰蛋白酶特异性底物为TAME·HCl或BAEE·HCl。本发明还提出了一种胰蛋白酶活性检测方法，包括：(1)制备胰蛋白酶活性检测试剂；(2)预处理；(3)检测参比溶液，平均吸光度变化值记为Δ<subgt;0</subgt;；(4)标准品浓度记为C<subgt;标</subgt;；平均吸光度变化值记为Δ<subgt;标</subgt;；(5)待测组分的胰蛋白酶浓度记为C<subgt;样</subgt;；平均吸光度变化值记为Δ<subgt;样</subgt;；(6)U<subgt;样</subgt;＝U<subgt;标</subgt;*活性比值，活性比值＝[(Δ<subgt;样</subgt;‑Δ<subgt;0</subgt;)*稀释倍数/C<subgt;样</subgt;]/[(Δ<subgt;标</subgt;‑Δ<subgt;0</subgt;)*稀释倍数/C<subgt;标</subgt;]*100％。本发明的胰蛋白酶活性检测试剂和方法，其检测胰蛋白酶活性的准确度较高。

技术研发人员：王昊,孙国龙,李奎,刘登辉,翟改萍,武慧锋,杨忍峰
受保护的技术使用者：上海品峰医疗科技有限公司
技术研发日：
技术公布日：2024/1/14