一种基于特征肽段评价核桃肽品质的方法及其应用与流程

本发明属于医药与食品检测，具体涉及一种基于特征肽段评价核桃肽品质的方法及其应用。

背景技术：

1、核桃具有包括抗氧化、抗炎、预防癌症和心血管疾病的多种生物活性。核桃蛋白质因其含有所有必需氨基酸被认为是优质蛋白质。然而，核桃蛋白质较差的溶解度限制了它们在功能性食品中的应用。与完整核桃蛋白相比，核桃蛋白的水解产物和/或核桃肽具有更好的水溶性和功能特性，例如具有低粘度、良好的发泡和乳化特性，同时还具有各种生物活性，例如抗氧化、抗肿瘤、抗高血压、抗病毒、抑制乙酰胆碱酯酶、免疫调节、保护心血管和神经等作用。所以核桃肽是一种很有前途的功能性食品成分来源。目前衍生自核桃蛋白的有效肽段氨基酸序列已有报道，并在脱脂核桃粉水解产物中发现了可能是核桃粉水解产物改善学习和记忆效果以及抗氧化的原因的序列fy、alped等生物活性肽。

2、近年来，核桃肽产品层出不穷，但目前核桃肽的检测仅仅依靠蛋白质含量测定、pcr检测和液相色谱法测定总肽含量，这些方法均存在准确度低，检测周期长，操作复杂，灵敏度低等缺点，市场上核桃肽产品的品质评价缺乏有效的检测方法，对评价核桃肽产品质量带来较大的阻碍。因此，发明一种快速、高效、高灵敏度的检测方法是有必要的。

技术实现思路

1、本发明的目的在于克服现有技术存在的不足，提供一种基于特征肽段评价核桃肽品质的方法及其应用，本发明可大大提高核桃肽中特征肽段的检测效率和准确度。

2、本发明的目的可以通过以下技术方案来实现：

3、一种基于特征肽段评价核桃肽品质的方法，包含如下步骤：

4、s1供试品溶液制备：分别精密称取不同厂家的核桃肽样品100mg，加入10ml 0.1％tfa三氟乙酸水溶液，超声溶解；将溶解在0.1％ tfa三氟乙酸水中的核桃肽溶液上样至预处理后的c18ye spe柱中；用0.1％ tfa三氟乙酸水溶液淋洗除杂，然后用80％ can乙腈溶液洗脱，收集洗脱液进行uplc-qtof/ms质谱分析；

5、s2利用uplc-qtof/ms质谱技术对不同厂家的核桃肽产品进行液相色谱-质谱检测，得到的质谱数据利用peaks studio11软件解析质谱数据，鉴定样品中的多肽序列并筛选出不同厂家核桃肽的共有肽段；

6、s3使用peaks studio11软件的de novo和db search模块对质谱数据进行解析，共发现263个核桃肽共有肽段，最终选定氨基酸序列为fy和alped这两个具有神经保护，提高学习效率和记忆力功能的核桃特征肽段；

7、s4通过氨基酸序列为fy和alped判断市场上其他核桃肽产品的多肽指纹图谱是否含有核桃肽特征肽段的离子信号及响应高低。

8、优选的，s1中can乙腈溶液含0.1％tfa三氟乙酸。

9、优选的，s2中液质分析时采用的色谱柱为hss t3，流速0.3ml/min，以0.1％甲酸-水溶液为流动相a，0.1％甲酸-乙腈溶液为流动相b进行梯度洗脱；洗脱程序为：0-2min，100％a；2-15min，100％-90％a；15-22min，90％-70％a；22-22.1min，70％-100％a，22.1-24min，100％a；图谱采集时间为24min；质谱条件：esi离子源，正离子模式；ida扫描模式；气帘气：35psi；gas1：45psi；gas2：45psi；温度：500℃；离子化压力：4500v；去簇电压：60v；全扫描范围：m/z 50～2000da；裂解电压：5v；cespread：0v。

10、优选的，s3中peaks studio11软件对质谱数据解析时，db search蛋白数据库来源为uniprot蛋白数据库的juglans regia物种，de novo解析参数为parent mass errortolerance 10.0ppm，fragment mass error tolerance0.1da；db search解析参数为parent mass error tolerance 10.0ppm，fragment mass error tolerance 0.1da，maxmissed cleavages 100，分析质谱数据。

11、优选的，使用一种基于特征肽段评价核桃肽品质的方法判断核桃肽产品的多肽指纹图谱是否含有核桃肽特征肽段的离子信号及响应高低：若含有且氨基酸序列fy和alped含量较高，则说明产品品质较好，若不含有或fy和alped含量较低则说明该产品品质不佳。

12、本发明的有益效果：(1)本发明公开了一种基于特征肽段评价核桃肽的液相色谱-质谱联用方法及其应用，利用核桃肽中的fy及alped两个特征肽段评价核桃肽的产品品质；(2)本发明中采用高分辨液质联用仪作为检测手段，只需要取样微量的核桃肽样品，即可达到有效检测目的；(3)本发明采用c18ye柱(1g，30μm)对样品除杂富集，相比与x1和hlb柱可大大提高富集能力；(4)本发明建立了完善的核桃肽的分离方法及质谱检测方法，通过质谱技术精确地识别不同厂家核桃肽中所有的多肽信息，筛选了核桃肽中的特征多肽作为质量标志物，为核桃肽的质量检测提供了可靠的依据，保障了消费者的权益。

技术特征：

1.一种基于特征肽段评价核桃肽品质的方法，其特征在于，包含如下步骤：

2.根据权利要求1所述的一种基于特征肽段评价核桃肽品质的方法，其特征在于，所述s1中can乙腈溶液含0.1%tfa三氟乙酸。

3. 根据权利要求1所述的一种基于特征肽段评价核桃肽品质的方法，其特征在于，所述s2中液质分析时采用的色谱柱为hss t3，流速0.3ml/min，以0.1%甲酸-水溶液为流动相a，0.1%甲酸-乙腈溶液为流动相b进行梯度洗脱；洗脱程序为：0-2min，100%a；2-15min，100%-90%a；15-22min，90%-70%a；22-22.1min，70%-100%a，22.1-24min，100%a；图谱采集时间为24min；质谱条件：esi离子源，正离子模式；ida扫描模式；气帘气：35psi；gas1：45psi；gas2：45psi；温度：500℃；离子化压力：4500v；去簇电压：60v；全扫描范围：m/z 50~2000da；裂解电压：5v；cespread：0v。

4. 根据权利要求1所述的一种基于特征肽段评价核桃肽品质的方法，其特征在于，所述s3中peaks studio11软件对质谱数据解析时，db search蛋白数据库来源为uniprot蛋白数据库的juglans regia物种，de novo解析参数为parent mass error tolerance10.0ppm，fragment mass error tolerance 0.1da；db search解析参数为parent masserror tolerance 10.0ppm，fragment mass error tolerance 0.1da，max missedcleavages 100，分析质谱数据。

5.一种基于特征肽段评价核桃肽品质的方法在评价核桃肽品质中的应用，其特征在于：使用如权利要求1至4中任一项所述的一种基于特征肽段评价核桃肽品质的方法，判断核桃肽产品的多肽指纹图谱是否含有核桃肽特征肽段的离子信号及响应高低：若含有且氨基酸序列fy和alped含量较高，则说明产品品质较好，若不含有或fy和alped含量较低则说明该产品品质不佳。

技术总结
本发明公开了一种基于特征肽段评价核桃肽品质的方法及其应用，肽段包括肽段一：FY和肽段二：ALPED。本发明运用质谱多肽组学定向分析技术，通过大量实验筛选得到两条核桃肽的特征肽段，这两条特征肽段具有很高的专属性，可用于鉴定核桃肽。并找到了不同厂家研究核桃肽在多肽成分和含量上的差异，并且本发明提供的核桃肽的鉴别方法，通过大量实验筛选出最佳的色谱条件和质谱条件，整个方法操作简单，准确性高，有利于核桃肽的质量控制，不需要单体对照品为对照，只根据核桃肽样品中特征肽段的质谱信息即可进行定性分析，可大大提高核桃肽中特征肽段的检测效率和准确度，可以填补核桃肽研究中的空白，对保证核桃肽的质量具有重要的意义。

技术研发人员：梁鑫淼,王超然,郭秀洁,杨佳颖,徐伟,董海临,金郁
受保护的技术使用者：泰州医药城国科化物生物医药科技有限公司
技术研发日：
技术公布日：2024/1/15