一种基于蓝、红色碳量子点的分子印迹比率荧光传感器检测噻虫嗪的方法

本发明属于分析检测领域，涉及一种基于蓝、红色碳量子点的分子印迹比率荧光传感器(b-cds@mips/r-cds)检测噻虫嗪的方法，更具体地，涉及一种基于比率荧光传感器、借助智能手机的高灵敏检测噻虫嗪的方法。

背景技术：

1、新烟碱类农药因其杀虫范围广、杀虫效率高而成为应用最广泛的农药之一。噻虫嗪(thiamethoxam,tmx)是新烟碱类杀虫剂之一，可通过激活烟碱乙酰胆碱受体(nachrs)阻断乙酰胆碱神经信号传递，导致昆虫死亡。近年来，研究表明噻虫嗪对人体健康有害，具有生殖毒性、肝癌毒性和肾毒性。考虑到噻虫嗪在生态系统中的广泛应用和长期滞留，可能会对生态系统和人类健康产生不利影响。因此，国际上已经采取了一些管理措施，限制它在世界范围内的使用。自2018年起，欧盟已经禁止噻虫嗪的大规模现场使用，并且规定噻虫嗪在蜂蜜和牛奶中的最大残留限量(mrls)为0.05mg/kg。因此，开发一种对食品和水环境中农药残留进行敏感检测的方法就显得尤为重要。

2、近年来，不同的分析策略被应用于农药残留检测，如高效液相色谱法(hplc)、液相色谱-质谱法(lc-ms)、酶联免疫吸附试验(elisa)和电化学方法等。然而，由于存在设备昂贵、对操作人员要求高、操作时间长等限制，上述方法不能满足快速、实时检测的需求。目前，荧光传感器被认为是一种很有前景的农药残留检测方法。碳量子点因其优异的光学性能、水溶性、生物相容性和稳定性而受到越来越多的关注。此外，基于碳量子点的荧光传感器具有卓越的灵敏度和简单的流程，可以实现可视化和现场检测。然而，传统的单发射荧光传感器容易受到外部环境干扰和操作员错误的影响，而且视觉识别能力也很差。比率荧光传感器不仅克服了上述缺点，还具有更低的检测限和更宽的线性范围。此外，双发射荧光传感器还可以拓宽颜色变化的范围，提高视觉检测的精度。

3、智能手机已经成为我们生活中必不可少的移动设备，由于其识别和分析数据的特性，已经成为传感器领域手持测试设备的研究热点。例如，jiang等贡献了一种荧光智能手机传感器，用于抗生素残留的视觉量化。另一项研究还开发了一种利用智能手机平台检测阿莫西林的比率荧光针。然而，基于智能手机的比率荧光传感器尚未被提出用于噻虫嗪浓度的可视化量化。

4、此外，对目标选择性强是评价传感器性能的重要指标。分子印迹技术是一种通过记忆模板分子的形状和大小来识别目标的技术。基于分子印迹技术合成的具有特定识别位点的分子印迹聚合物(mips)具有稳定性好、价格低廉、操作简单等优点，已被广泛应用于选择性识别复杂体系中的目标物。mips的引入提供了选择性识别元件，提高了传感器的选择性，满足了复杂食品或环境基质中农药残留检测的需求。因此，碳量子点与mips相结合的比率荧光传感器将为实际样品中tmx残留的方便检测提供可靠的方法。

技术实现思路

1、本发明的目的是克服现有检测方法灵敏度低、检测耗时、成本过高以及步骤繁琐的缺点，构建了一种新型的分子印迹比率荧光传感系统(b-cds@mips/r-cds)，并将该传感系统用于噻虫嗪的检测，提供了一种基于蓝、红色碳量子点的分子印迹比率荧光传感器检测噻虫嗪的方法，该方法能够简单快速、直观的、高灵敏的检测噻虫嗪，在荧光检测的同时实现检测结果肉眼可见的结果。

2、为了实现上述目的，本发明采用以下技术方案：

3、一种基于蓝、红色碳量子点的分子印迹比率荧光传感器检测噻虫嗪的方法，包括如下步骤：

4、步骤(a)、合成b-cds(n和p共掺杂的蓝色发射碳量子点)和r-cds：通过微波辅助法合成b-cds：将苯胺、磷酸及乙二胺加入超纯水中得到均相水溶液，对均相水溶液进行微波加热处理，冷却，凝固成凝胶，将凝胶溶解在超纯水中，离心，取上清液，即为b-cds溶液；采用超声辅助乙醇萃取法制备r-cds：将绿茶粉末分散在含水量0～5％v/v的乙醇-水溶液中，超声提取，过滤，得到r-cds(红色碳量子点)溶液；

5、步骤(b)、构建比率荧光传感器b-cds@mips/r-cds：采用溶胶-凝胶法合成b-cds@mips：将1～5ml b-cds溶液和0.1～0.5ml氨水加入到30ml乙醇-水混合溶液中，搅拌均匀，加入0.2～0.5ml aptes(3-氨丙基三乙氧基硅烷)和10～40mg噻虫嗪；将0.2～2ml teos(硅酸四乙酯)溶于10ml无水乙醇中，逐滴加入到上述溶液中，搅拌，得到沉淀；沉淀经数次洗脱得到b-cds@mips，将b-cds@mips分散于无水乙醇得到b-cds@mips分散液；将b-cds@mips分散液和r-cds溶液混合构建得到比率荧光传感器；

6、步骤(c)、噻虫嗪的检测：采用无水乙醇配制不同浓度的噻虫嗪溶液，将等体积不同浓度的噻虫嗪溶液分别添加到步骤(b)构建的比率荧光传感器中，并用无水乙醇稀释至特定体积，得到孵育体系，孵育反应；利用荧光分光光度计，在380nm激发波长下，记录相应的410～730nm荧光光谱，以噻虫嗪浓度的对数(ln c)为横坐标，以433nm与684nm处的荧光比值f433/f684为纵坐标，建立噻虫嗪标准曲线；

7、步骤(d)、样品检测：待测样品进行预处理得到待测样品溶液，将待测样品溶液添加到步骤(b)构建的比率荧光传感器中，并用无水乙醇稀释至特定体积得到检测体系，孵育反应；按照步骤(c)测得未知噻虫嗪浓度的待测样品的荧光比值，代入步骤(c)的噻虫嗪标准曲线，得到待测样品中噻虫嗪的浓度。

8、步骤(a)中，所述的苯胺、磷酸和乙二胺的体积比为(1～4):(2～7):(2～5)，优选为(2～4):(4～6):(2～4)，进一步优选为3:5:3。

9、所述的苯胺的纯度≥99.5％；所述的磷酸的纯度≥98.0％；所述的乙二胺的纯度≥99.0％。

10、所述的苯胺和超纯水的体积比为1:5～1:20，优选为1:8～1:10，且配制均相水溶液使用的超纯水和溶解凝胶的超纯水的体积比为1:10。

11、所述的微波加热处理在微波炉中进行，微波炉的功率为700w，微波加热处理的时间为0.5～2min。

12、所述的离心的转速为12000rpm，离心的时间为10分钟，上清液为含有n和p共掺杂的蓝色碳量子点溶液。

13、优选的，所述的b-cds溶液的浓度为10mg/ml。

14、所述的绿茶粉末和含水量0～5％v/v的乙醇-水溶液的料液比为1:50～1:5g/ml，优选为3:50g/ml。

15、所述的超声提取的超声波功率为300w，时间为30～90分钟。

16、所述的过滤采用0.45μm滤膜。

17、优选的，采用超声辅助乙醇萃取法制备r-cds：按照绿茶粉末和无水乙醇-水溶液的料液比为3:50g/ml，将绿茶粉末分散在无水乙醇中，在超声波功率为300w下超声提取30～90分钟，采用0.45μm滤膜过滤，得到r-cds溶液。

18、优选的，所述的b-cds溶液的浓度为10mg/ml。

19、步骤(b)中，所述的氨水的质量分数为25％。

20、所述的乙醇-水混合溶液是无水乙醇和水体积比1:1～5:1，优选为1:2的混合溶液。

21、所述的洗脱液为甲醇-乙酸混合溶液，甲醇和乙酸体积比为6:1～10:1，优选为9:1。

22、所述的洗脱方式为：每次加入洗脱液，超声40分钟，12000rpm离心10分钟，收集沉淀。

23、所述的洗脱次数为3～9次，优选为5次。

24、所述的b-cds@mips分散液与r-cds溶液的体积比为1:0.2～1:5，优选为1:1～1:2，进一步优选为1:1.6(即5:8)。

25、优选的，所述的b-cds@mips的合成方法为：将2ml b-cds溶液和0.2ml氨水加入到30ml乙醇-水混合溶液中，搅拌均匀，加入0.1ml aptes和20mg噻虫嗪；将1ml teos溶于10ml无水乙醇中，逐滴加入到上述溶液中，搅拌，得到沉淀；沉淀经5次洗脱得到b-cds@mips。

26、步骤(c)中，所述的孵育体系中b-cds@mips的终浓度为100～150mg/l，优选为125mg/l；孵育体系的终体积为1～5ml，优选为2ml；噻虫嗪溶液的体积为孵育体系的体积的1/2。

27、在比率荧光传感器中加入等体积不同浓度的噻虫嗪溶液，使孵育体系中噻虫嗪的终浓度为0.05～25μm。具体的，孵育体系中噻虫嗪的终浓度可以分别为0.05、0.125、0.25、0.5、1、2.5、5、12.5、25μm。

28、具体的，所述的孵育体系为：将0.25ml b-cds@mips分散液和0.4ml r-cds溶液混合构建得到比率荧光传感器，加入等体积不同浓度的噻虫嗪溶液，加入无水乙醇至孵育体系终体积为2ml，且孵育体系中b-cds@mips的终浓度为125mg/l。

29、所述的孵育反应的温度为30～55℃，优选为37～45℃，进一步优选为37℃；孵育反应的时间为10～50分钟，优选为25～30℃，进一步优选为30分钟。

30、步骤(d)中，检测体系的终体积为1～5ml，优选为2ml；待测样品溶液的体积为检测体系的体积的1/20。

31、具体的，所述的监测体系为：将0.25ml b-cds@mips分散液和0.4ml r-cds溶液混合构建得到比率荧光传感器，加入0.1ml待测样品溶液，加入无水乙醇至检测体系终体积为2ml，且检测体系中b-cds@mips的终浓度为125mg/l。

32、所述的孵育反应的温度为30～55℃，优选为37～45℃，进一步优选为37℃；孵育反应的时间为10～50分钟，优选为25～30℃，进一步优选为30分钟。

33、还包括：观察365nm紫外灯下荧光颜色的变化，根据荧光颜色对噻虫嗪进行定性。当待测样品不含噻虫嗪时，检测体系的荧光颜色呈现粉紫色；如果待测样品中含有噻虫嗪，随着待测样品中噻虫嗪的含量增加，检测体系的荧光颜色逐渐向浅紫、浅蓝色变化，具体变化趋势为：粉红、深紫、浅紫、浅蓝，及两色之间的过渡色等。

34、作为本发明所述的基于蓝、红色碳量子点的分子印迹比率荧光传感器检测噻虫嗪的方法，还包括：

35、步骤(e)、基于智能手机应用的可视化检测：采用无水乙醇配制不同浓度的噻虫嗪溶液，将等体积不同浓度的噻虫嗪溶液分别添加到步骤(b)构建的比率荧光传感器中，并用无水乙醇稀释至特定体积，得到孵育体系，孵育反应；在日光灯下，颜色无法判定，只有在365nm紫外灯下荧光颜色才可见，以此实现检测结果肉眼可见；观察365nm紫外灯下荧光颜色，随着噻虫嗪浓度的升高，荧光颜色呈现从红色到蓝色变化趋势；当365nm紫外灯照射下，使用颜色识别应用程序记录荧光图片，并将荧光颜色转换为rgb值，以噻虫嗪的浓度为横坐标、以蓝通道/红通道的比值(b/r)为纵坐标，建立标准曲线；

36、步骤(f)、样品检测：待测样品进行预处理得到待测样品溶液，将待测样品溶液添加到步骤(b)构建的比率荧光传感器中，并用无水乙醇稀释至特定体积得到检测体系，孵育反应；观察365nm紫外灯下荧光颜色，根据荧光颜色对噻虫嗪进行定性；按照步骤(e)测得未知噻虫嗪浓度的待测样品的蓝通道/红通道的比值(b/r)，代入步骤(e)的标准曲线，得到待测样品中噻虫嗪的浓度。

37、步骤(e)中，所述的孵育体系中b-cds@mips的终浓度为100～150mg/l，优选为125mg/l；孵育体系的终体积为1～5ml，优选为2ml；噻虫嗪溶液的体积为孵育体系的体积的1/2。

38、在比率荧光传感器中加入等体积不同浓度的噻虫嗪溶液，使孵育体系中噻虫嗪的终浓度为0.125～20μm。具体的，孵育体系中噻虫嗪的终浓度可以分别为0.125、0.25、0.5、1、2.5、5、10、15、20μm。

39、所述的孵育反应的温度为30～55℃，优选为37～45℃，进一步优选为37℃；孵育反应的时间为10～50分钟，优选为25～30℃，进一步优选为30分钟。

40、当待测样品不含噻虫嗪时，检测体系的荧光颜色呈现粉紫色；如果待测样品中含有噻虫嗪，随着待测样品中噻虫嗪的含量增加，检测体系的荧光颜色逐渐向浅紫、浅蓝色变化，具体变化趋势为：粉红、深紫、浅紫、浅蓝，及两色之间的过渡色等。

41、所述的颜色量化指标为rgb三颜色通道。

42、步骤(f)中，检测体系的终体积为1～5ml，优选为2ml；待测样品溶液的体积为检测体系的体积的1/20。

43、具体的，所述的监测体系为：将0.25ml b-cds@mips分散液和0.4ml r-cds溶液混合构建得到比率荧光传感器，加入0.1ml待测样品溶液，加入无水乙醇至检测体系终体积为2ml，且检测体系中b-cds@mips的终浓度为125mg/l。

44、所述的孵育反应的温度为30～55℃，优选为37～45℃，进一步优选为37℃；孵育反应的时间为10～50分钟，优选为25～30℃，进一步优选为30分钟。

45、所述的待测样品为食品样本、环境样本；所述的食品样本为蔬菜、水果；所述的环境样本为河水、湖水。

46、待测样品预处理：食品样本用蒸馏水清洗，经过清洗的食品样本切碎，按照料液比1:20g/ml，将切碎的食品样本和无水乙醇混合，超声提取4h，提取液离心，上清液用0.45μm膜过滤，得到待测样品溶液；环境样本离心，上清液用0.45μm膜过滤，得到待测样品溶液。

47、具体的，提取液以转速14000rpm离心10分钟；环境样本以转速14000rpm离心10分钟。

48、本发明方法的检测机理为(图1)：利用溶胶-凝胶法合成b-cds@mips，通过分子印迹层修饰b-cds。此外，aptes作为制备mips的功能单体，由于烷基胺基团的存在，可以使b-cds激发态电子发生非辐射。以上两点导致b-cds@mips的荧光强度减弱。但是，由于噻虫嗪的作用，b-cds@mips的荧光强度增加。一方面，这种现象可能是由于烷基胺基团被tmx识别和连接而钝化。另一方面，可能是因为具有-no2官能团的tmx结构可以进入印迹腔内，与b-cds表面的-cooh和-oh官能团形成氢键，荧光增强。而作为参考的r-cds对tmx无反应。最终，蓝色荧光增强，传感系统的颜色显示红到蓝的变化，从而能够使tmx检测结果可视化。

49、与现有技术相比，本发明具有如下显著优点：

50、1、使用蓝色和红色发射碳量子点构建的“turn-on”分子印迹比率荧光传感器，既具有分子印迹复合材料的高选择性，又具有比率荧光传感器的自校正功能。

51、2、与单信号荧光传感器相比较，b-cds@mips/r-cds具有更低的检测限(单信号荧光传感器的线性lod为32nm，比率荧光传感器的线性lod为13.5nm)和更宽的线性范围(单信号荧光传感器的线性范围为0.05～5μm，比率荧光传感器的线性lod为0.05～25μm)，并且拓宽了颜色变化范围。

52、3、本发明方法通过智能手机上的颜色识别软件，将颜色变化转换为具体的rgb数值，使检测结果可视化，可以实现食品安全的实时评估和现场检查。