一种心肌N69蛋白保护液和心肌N69蛋白检测试剂盒的制作方法

本申请涉及生物医药，尤其是涉及一种心肌n69蛋白保护液和心肌n69蛋白检测试剂盒。

背景技术：

1、随着我国人口老龄化及生活城镇化的加剧，以及亚健康问题的日益突出，我国心血管病（cardiovascular disease，cvd）的发病率持续增高。据《中国心血管健康与疾病报告2020》报道，中国cvd患病率处于持续上升阶段。2018年中国医院心脑血管病患者出院总人次数为2316.13万人次，占同期出院总人次数的12.80%；其中，心血管病占6.31%，脑血管病占6.48%。cvd患者出院人次数中，缺血性心脏病占比最高（36.95%）。1980~2018年，中国cvd患者出院人次数年均增速为9.73%，快于同期全病种出院人次数的年均增速（6.34%），其中年均增速前三位的疾病依次为脑梗死（12.03%）、缺血性心脏病（11.22%）和急性心肌梗死（10.94%）。心血管病给居民和社会带来的经济负担日渐加重，已成为重大的公共卫生问题。

2、目前，检测心肌缺血的方法主要有心电图、冠状动脉cta和心肌标志物检测。心电图是心肌缺血诊断中常用的方法之一，具有较高的敏感性和特异性且方便、快捷，但对于短暂发作的心肌缺血，只有在心肌缺血发作期，心电图有比较明显的改变，一旦缺血缓解，则心电图恢复正常，对于缺血程度较轻的患者心电图变化不显著。冠状动脉cta主要用于冠状动脉狭窄的判断，其检测方法为：经外周静脉注射造影剂后，利用螺旋ct扫描、计算机处理重建，获得心脏冠状动脉成像，能够很好判断冠状动脉是否存在硬化、钙化、狭窄或闭塞，其准确率高达90%，但与冠状动脉造影相比尚存一定的差别，且存在少量患者注射造影剂后出现过敏不良反应。冠状动脉造影是诊断冠心病的金标准，需要从手部或腿部进行动脉穿刺，会出现血管损伤或其他相关并发症，存在一定风险，属于有创检验。冠状动脉造影需要使用碘造影剂，即使在检查前做过碘过敏皮肤试验，少数患者也会发生过敏反应或可能出现严重并发症，如心律失常、急性心肌梗死，甚至因疾病导致心脏破裂，可能危及生命。

3、与上述方法相比，心肌标志物检测凭借其无创、快速、特异性高和窗口期短等特点，广泛应用于心肌缺血或心肌损伤的早期诊断。作为曾经心肌梗死诊断的金标准，肌酸激酶同工酶（ckmb）已逐步被肌钙蛋白（ctn）所取代，肌钙蛋白已经成为全球公认的心肌损伤诊断的金标准。在心肌细胞损伤早期，游离于胞浆内的ctn快速释放出来，血清/血浆中水平在4～6h升高，在急性心肌梗死发生后8～14h达峰值，但ctn无法满足临床早期（0-3小时内）心肌缺血导致心肌损伤检测的需要。

4、近期有研究发现，心肌缺血-再灌注过程中，钙蛋白酶1可介导酶解ctnt的n端第69位置，产生心肌n69蛋白，可能是应激条件下调节肌肉收缩力的一种急性机制。n69其分子量约8kd，约为ctnt完整分子（34kd）的四分之一，在心肌缺血导致心肌损伤的早期（心肌坏死前）可以先于ctnt或ctn-itc复合物之前进入血液，对于早期诊断早期心肌缺血导致的心肌损伤具有重大意义。但是，由于n69蛋白校准品不易长期保存，以及缺少临床研究等问题，目前并未有n69蛋白检测产品。

技术实现思路

1、为了解决上述至少一种技术问题，开发一种能够有效、长期保存n69蛋白校准品，并且能够快速、准确检测n69蛋白的检测产品，本申请提供一种心肌n69蛋白保护液和心肌n69蛋白检测试剂盒。

2、一方面，本申请提供了一种心肌n69蛋白保护液，所述心肌n69蛋白保护液的配比包括：0.12%~0.48%质量分数的tris-hcl缓冲液，1%~5%质量分数的bsa或0.1%~0.5%质量分数的酪蛋白钠，0.2%~2%质量分数的edta二钠，5%~20%质量分数的海藻糖，0.02%~0.06%体积分数的表面活性剂，0.08%~0.12%体积分数的防腐剂；还包括蛋白酶抑制剂和还原剂。

3、可选的，所述tris-hcl缓冲液的ph不低于7.2。

4、可选的，所述蛋白酶抑制剂为0.05%~0.3%质量分数的苯甲脒和/或的0.5%~2%质量分数的抑酞酶。

5、可选的，所述还原剂为0.5%~3%质量分数的维生素c和0.2%~0.8%质量分数的三（2-甲酰乙基）膦盐酸盐。

6、可选的，所述表面活性剂为吐温20，所述防腐剂为proclin300。

7、可选的，所述心肌n69蛋白保护液的优选配比包括：0.24%质量分数的ph7.4的tris-hcl缓冲液、2%质量分数的bsa、0.4%质量分数的edta二钠、0.15%质量分数的苯甲脒、1%质量分数的抑酞酶、10%质量分数的海藻糖、1.5%质量分数的维生素c、0.4%质量分数的三（2-甲酰乙基）膦盐酸盐、0.04%体积分数的吐温20，以及0.1%体积分数的proclin300。

8、另一方面，本申请提供了一种心肌n69蛋白检测试剂盒，包括试剂条和校准品；所述试剂条至少1个样本孔、11个试剂孔和1个避光检测杯，沿试剂条呈直线布置；所述样本孔用于加载样本，所述位于样本孔一侧的试剂孔装载工作洗液，所述位于避光检测杯一侧的三个试剂孔分别装载酶标抗体试剂、磁珠试剂和化学发光底物液，所述避光检测杯用于检测化学发光信号；所述校准品采用n69蛋白标准品和上述的心肌n69蛋白保护液配置。

9、可选的，所述工作洗液包括200mm的ph8.0的tris-hcl缓冲液，0.9%质量分数的nacl，0.5%体积分数的吐温20，以及0.1%体积分数的proclin300。

10、可选的，所述酶标抗体试剂酶标物稀释液按比例稀释的alp标记的n69抗体，所述酶标物稀释液包括200mm的ph8.0的tris-hcl缓冲液，0.9%质量分数的nacl，3%质量分数的bsa，10%体积分数的稳定剂，以及0.1%体积分数的proclin300。

11、可选的，所述磁珠工作液试剂为磁珠稀释液按比例稀释的偶联磁珠的n69抗体，所述磁珠稀释液包括200mm的ph8.0的tris-hcl缓冲液，0.9%质量分数的nacl，30%体积分数的甘油、10%质量分数的明胶、5%质量分数的海藻糖、0.1%体积分数的proclin300。

12、综上所述，本发明包括以下至少一种有益技术效果：

13、1. 本发明提供的心肌n69蛋白保护液，采用适宜的配比，能够对n69蛋白提供长效的保存保护，可以有效、长期的保存心肌n69蛋白校准品。

14、2. 本发明通过本申请设计的心肌n69蛋白保护液，制备出了能够长效保存的校准品，进而设计了心肌n69蛋白检测试剂盒，有效填补了市场空缺，能够对心肌缺血提供早期、精准的诊断。

15、3. 本发明配置简单，组分易于获取，成本相对低廉，检测精度也较高。

技术特征：

1.一种心肌n69蛋白保护液，其特征在于，所述心肌n69蛋白保护液的配比包括：0.12%~0.48%质量分数的tris-hcl缓冲液，1%~5%质量分数的bsa或0.1%~0.5%质量分数的酪蛋白钠，0.2%~2%质量分数的edta二钠，5%~20%质量分数的海藻糖，0.02%~0.06%体积分数的表面活性剂，0.08%~0.12%体积分数的防腐剂；还包括蛋白酶抑制剂和还原剂。

2.根据权利要求1所述的一种心肌n69蛋白保护液，其特征在于，所述tris-hcl缓冲液的ph不低于7.2。

3.根据权利要求1所述的一种心肌n69蛋白保护液，其特征在于，所述蛋白酶抑制剂为0.05%~0.3%质量分数的苯甲脒和/或的0.5%~2%质量分数的抑酞酶。

4.根据权利要求1所述的一种心肌n69蛋白保护液，其特征在于，所述还原剂为0.5%~3%质量分数的维生素c和0.2%~0.8%质量分数的三（2-甲酰乙基）膦盐酸盐。

5.根据权利要求1所述的一种心肌n69蛋白保护液，其特征在于，所述表面活性剂为吐温20，所述防腐剂为proclin300。

6.根据权利要求1所述的一种心肌n69蛋白保护液，其特征在于，所述心肌n69蛋白保护液的配比包括：0.24%质量分数的ph7.4的tris-hcl缓冲液、2%质量分数的bsa、0.4%质量分数的edta二钠、0.15%质量分数的苯甲脒、1%质量分数的抑酞酶、10%质量分数的海藻糖、1.5%质量分数的维生素c、0.4%质量分数的三（2-甲酰乙基）膦盐酸盐、0.04%体积分数的吐温20，以及0.1%体积分数的proclin300。

7.一种心肌n69蛋白检测试剂盒，其特征在于，包括试剂条和校准品；所述试剂条至少1个样本孔、11个试剂孔和1个避光检测杯，沿试剂条呈直线布置；所述样本孔用于加载样本，所述位于样本孔一侧的试剂孔装载工作洗液，所述位于避光检测杯一侧的三个试剂孔分别装载酶标抗体试剂、磁珠试剂和化学发光底物液，所述避光检测杯用于检测化学发光信号；所述校准品采用n69蛋白标准品和如权利要求1~8任意一项所述的心肌n69蛋白保护液配置。

8.根据权利要求7所述的一种心肌n69蛋白检测试剂盒，其特征在于，所述工作洗液包括200mm的ph8.0的tris-hcl缓冲液，0.9%质量分数的nacl，0.5%体积分数的吐温20，以及0.1%体积分数的proclin300。

9.根据权利要求7所述的一种心肌n69蛋白检测试剂盒，其特征在于，所述酶标抗体试剂酶标物稀释液按比例稀释的alp标记的n69抗体，所述酶标物稀释液包括200mm的ph8.0的tris-hcl缓冲液，0.9%质量分数的nacl，3%质量分数的bsa，10%体积分数的稳定剂，以及0.1%体积分数的proclin300。

10.根据权利要求7所述的一种心肌n69蛋白检测试剂盒，其特征在于，所述磁珠工作液试剂为磁珠稀释液按比例稀释的偶联磁珠的n69抗体，所述磁珠稀释液包括200mm的ph8.0的tris-hcl缓冲液，0.9%质量分数的nacl，30%体积分数的甘油、10%质量分数的明胶、5%质量分数的海藻糖、0.1%体积分数的proclin300。

技术总结
本申请公开了一种心肌N69蛋白保护液和心肌N69蛋白检测试剂盒。本申请设计了一种心肌N69蛋白保护液，所述心肌N69蛋白保护液的配比包括：0.12%~0.48%质量分数的Tris‑HCl缓冲液，1%~5%质量分数的BSA或0.1%~0.5%质量分数的酪蛋白钠，0.2%~2%质量分数的EDTA二钠，5%~20%质量分数的海藻糖，0.02%~0.06%体积分数的表面活性剂，0.08%~0.12%体积分数的防腐剂为ProClin300；还包括蛋白酶抑制剂和还原剂。本申请还设计了心肌N69蛋白检测试剂盒。本申请能够有效、长期保存N69蛋白校准品，并且能够快速、准确检测N69蛋白。

技术研发人员：彭京胜,王琳
受保护的技术使用者：普十生物科技（北京）有限公司
技术研发日：
技术公布日：2024/1/15