一种基于二氧化锰纳米片检测心肌肌钙蛋白I的方法

本发明属于纳米生物传感，具体涉及一种基于二氧化锰纳米片检测心肌肌钙蛋白i的方法。

背景技术：

1、二氧化锰，是一种无机化合物，化学式为mno2，为黑色无定形粉末或黑色斜方晶体，具有独特的物理化学性质，在生物治疗、生物传感、细胞工程、能量储存、催化剂、环境修复等领域得到了广泛的关注，特别是二氧化锰纳米片凭借其固有的优点，在生物医学应用领域引起了人们的热烈研究。

2、心肌肌钙蛋白i（ctni）为心肌组织特有的一种调节蛋白，可抑制肌球蛋白与肌动蛋白结合，在心肌收缩过程中起重要作用。ctni是心肌细胞损伤最敏感和最特异性的血清标志物之一，已逐渐成为判断急性心肌梗死患者心肌细胞损伤的主要生化指标。因此，对心肌肌钙蛋白i的检测是一种重要的工作，目前虽然存在较多的心肌肌钙蛋白i检测方法，比如胶体金法、化学发光法等，但是这些方法的检出限较高，难以检测一些低浓度的心肌肌钙蛋白i。

技术实现思路

1、为解决至少一种上述问题，本发明提出了一种二氧化锰纳米片在心肌肌钙蛋白i检测方面的应用，该方法检测心肌肌钙蛋白i的检测限极低，能够检测微量的心肌肌钙蛋白i。

2、本发明的技术方案如下：一种基于二氧化锰纳米片检测心肌肌钙蛋白i的方法，包括以下步骤：

3、前驱体的制备：取浓度为0.15~0.25mg/ml的二氧化锰纳米片分散液，将其和2~3μg/ml的聚乙烯亚胺溶液混合并反应1~2h，后除去未反应的聚乙烯亚胺溶液；将产物与浓度为80~120μg/ml的心肌肌钙蛋白i抗体溶液、浓度为8~15μg/ml的牛血清白蛋白抗体溶液混合并在不高于4℃的条件下孵育12~14h，后将其分离提纯即得；其中，二氧化锰纳米片分散液、聚乙烯亚胺溶液和心肌肌钙蛋白i抗体溶液的体积相等，牛血清白蛋白抗体溶液和心肌肌钙蛋白i抗体溶液的体积比为5:100；

4、检测前操作：取浓度为80~110μg/ml的心肌肌钙蛋白i抗体溶液在检测皿中培养10~15h，后除去前述心肌肌钙蛋白i抗体溶液，后在检测皿中加入80~110μg/ml的牛血清白蛋白溶液并培养20~60min，除去前述牛血清白蛋白溶液，在检测皿中继续加入心肌肌钙蛋白i待测液并培养0.5~2h，除去前述心肌肌钙蛋白i待测液，在检测皿中加入浓度为0.15~0.25mg/ml的前驱体分散液并孵育50~80min，除去前驱体分散液，在检测皿中加入浓度ph为3.6~5.0、浓度为2mm的hac-naac缓冲溶液、浓度为10mm的3,3',5,5'-四甲基联苯胺溶液孵育5~10min；其中，心肌肌钙蛋白i抗体溶液、牛血清白蛋白溶液、心肌肌钙蛋白i待测液、前驱体分散液、hac-naac缓冲溶液和3,3',5,5'-四甲基联苯胺溶液的体积比为1:0.95~1.05：0.95~1.05：0.95~1.05：1.6~2.0：0.15~0.25；

5、将上述反应后的产物进行紫外-可见光谱检测。

6、同时，对于上述的检测，可以采用标准曲线法获得心肌肌钙蛋白i待测液中，心肌肌钙蛋白i的准确含量。其中，标准曲线法是事先采用一系列不同浓度的标准心肌肌钙蛋白i溶液进行测试，最终制得标准曲线，对于后续的待测溶液，测得其吸光度值后，根据标准曲线进行计算即得。这些属于本领域常识，因此对其具体操作步骤不予赘述。

7、同时，在本发明中，通常是采用透光性好、不会影响紫外-可见光检测的微量滴定板作为检测皿，但是在实际过程中，本领域技术人员可采用其余的、不影响紫外-可见光检测的容器作为检测皿。当然，在检测前操作过程中，需要多种物质在检测皿上生长，因此，要求检测皿通常为塑料材质，比如聚丙烯。

8、本发明的一种实施方式在于，所述二氧化锰纳米片采用以下方式制备：取高锰酸钾将其配置为0.8~1.2mg/ml的水溶液，在水溶液中加入现榨橙汁或橘汁，在室温条件下搅拌反应15~50min，反应结束后，对其进行分离提纯即得，其中，水溶液和橙汁或橘汁的体积比为8：0.8~1.3。

9、进一步的，所述现榨橙汁或橘汁是指，将橙子或橘子榨汁后，1min中内的橙汁或橘汁。因此，通常的操作是，在将橙子或橘子榨汁后，立即将其加入高锰酸钾溶液中。发明人经过大量测试发现，通常所采用的橙子或橘子都能够满足本发明的需求：比如常见的脐橙（赣南早脐橙、清家脐橙）、血橙（塔罗科血橙）、甜橙（冰糖橙）、砂糖橘、不知火等等都能应用于本发明。

10、对于聚乙烯亚胺，可以采用本领域常见的、水溶性聚乙烯亚胺，其聚合度可以为50~120。

11、具体的，在本发明中，采用现榨橙汁或现榨橘汁，主要是利用其内部的vc（维生素c）将高锰酸钾还原成二氧化锰纳米片，因此，通常要求鲜榨橙汁或现榨橘汁中的vc含量过量，同时，现榨橙汁或现榨橘汁中还有部分物质可能会对二氧化锰纳米片进行改性：发明人尝试过采用单纯的vc，发现其虽然同样能够制得二氧化锰纳米片，但是其在检测心肌肌钙蛋白i方面的能力不如利用现榨橙汁或现榨橘汁。

12、本发明的一种实施方式在于，所述前驱体的制备过程中的分离提纯步骤的具体操作为：取产物，除去液相，并采用pbs缓冲液洗涤数次即得，对于pbs缓冲液，其是常见的生物检测过程中所用的缓冲液，因此在此对其配比不予赘述，同时，在本步骤中，其ph为7~7.5，优选为7.2。

13、本发明的一种实施方式在于，检测前操作中，除去检测皿中的溶液或分散液的具体操作为：取培养或孵育后的产物，除去液相，后用pbs缓冲液洗涤检测皿数次即得。同时，在本步骤中，pbs缓冲液的ph为7-7.5，优选为7.2。

14、本发明的一种实施方式在于，所述心肌肌钙蛋白i待测液中，心肌肌钙蛋白i浓度大于0.7pg/ml。本发明中，对心肌肌钙蛋白i的检测限为0.7pg/ml，因此，要求溶液中心肌肌钙蛋白i的浓度大于0.7pg/ml，同时，从理论上讲，本发明对心肌肌钙蛋白i的检测上限为10ng/ml，但是，本领域技术人员清楚的是，对于浓度过高的溶液，可将其稀释后进行检测，因此，对心肌肌钙蛋白i的上限并无要求。

15、本发明的一种实施方式在于，所述3,3',5,5'-四甲基联苯胺溶液的溶剂为二甲亚砜。对于tmb（3,3’,5,5’–四甲基联苯胺）溶液，要求其溶剂即能够溶解tmb，同时，该溶剂还能够溶于水，因此，可选择二甲基甲酰胺、二甲亚砜、丙酮等常见的溶剂，但是从性能上来讲，优选二甲亚砜。

16、本发明的有益效果在于：

17、本发明的方法，利用现榨橙汁或现榨橘汁制备二氧化锰纳米片，并用该二氧化锰纳米片作为生物传感器对心肌肌钙蛋白i进行检测，能够对微量的心肌肌钙蛋白i进行检测，且其检测限极低，能够达到0.7pg/ml，远优于现有的检测方法，同时其具有较好的选择性，常见的干扰物质均难以对其检测造成干扰。

技术特征：

1.一种基于二氧化锰纳米片检测心肌肌钙蛋白i的方法，其特征在于，包括以下步骤：

2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述二氧化锰纳米片采用以下方式制备：取高锰酸钾将其配置为0.8~1.2mg/ml的水溶液，在水溶液中加入现榨橙汁或橘汁，在室温条件下搅拌反应15~50min，反应结束后，对其进行分离提纯即得，其中，水溶液和橙汁或橘汁的体积比为8：0.8~1.3。

3.根据权利要求1所述的方法，所述现榨橙汁或橘汁是指，将橙子或橘子榨汁后，1min中内的橙汁或橘汁。

4.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述前驱体的制备过程中的分离提纯步骤的具体操作为：取产物，除去液相，并采用pbs缓冲液洗涤数次即得。

5.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，检测前操作中，除去检测皿中的溶液或分散液的具体操作为：取培养或孵育后的产物，除去液相，后用pbs缓冲液洗涤检测皿数次即得。

6.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述心肌肌钙蛋白i待测液中，心肌肌钙蛋白i浓度大于0.70 pg/ml。

7.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述3,3',5,5'-四甲基联苯胺溶液的溶剂为二甲亚砜。

技术总结
本发明提供了一种基于二氧化锰纳米片检测心肌肌钙蛋白I的方法，涉及纳米生物传感技术领域。包括以下步骤：首先将二氧化锰纳米片与聚乙烯亚胺、cTnI抗体、BSA抗体进行预处理，随后将cTnI抗体、BSA、待测cTnI液在检测皿中结合，后加入预处理后的二氧化锰纳米片孵育一段时间，后加入缓冲液和TMB孵育一段时间，即可将其进行紫外‑可见光检测。本发明的方法，其检测限较低，能够较为容易的检测出低浓度的cTnI，具有较好的应用前景。

技术研发人员：付宸航,李贺,张智,彭桃梅,罗宇潇
受保护的技术使用者：成都信息工程大学
技术研发日：
技术公布日：2024/1/13