用于检测双靶点药物受体占有率的方法与流程

本申请属于生物分析领域，主要涉及用于检测双靶点药物的第一靶点受体占有率的方法。

背景技术：

1、受体占有率(receptor occupancy，ro)是检测药物与细胞表面靶点结合的程度，是评价靶向药物靶点作用水平最直接的药效动力学(pd)指标。在临床前研究中，ro可以反映药物浓度和药效之间的关系，评估生物制剂的最小生物学效应，从而进行剂量和给药方案的设定。在安全评估研究中，药物与靶点的结合情况可能与人体中的结合情况有差异，ro可以评估异种动物中药物与靶点的结合水平，并且异种动物中更易产生抗药抗体(anti-drug antibody，ada)，因此ro的检测可以评估ada对药效的影响，并且还可以评估高水平和持续的受体占位与毒副作用之间的关系。在药效学研究中，ro常常与pk结合起来进行模型构建，以此来调整实验设计，剂量选择等等。因此，受体占有率的测定正受到越来越多的关注和重视。

2、ro的基本检测模式有两种，即结合模式(bound)和游离模式(free)。结合模式检测被药物占据的受体水平，即将非竞争性的抗药抗体进行荧光标记或者生物素标记作为检测抗体，对于单抗药物，也可以用种属抗体，总受体水平通过在样本中加入过量药物进行检测，受体占有率(%)=结合药物量/总药物量×100%。游离模式检测未被药物占据的受体水平，采用荧光标记的药物，或者与药物具有绝对竞争关系的抗靶点抗体，检测游离受体水平，总受体水平可以通过给药前样本获得，也可以通过与药物具有非竞争关系的抗靶点抗体获得，受体占有率(%)=1-游离受体/总受体×100%。受体占有率的计算一般基于荧光中位数(mfi)或者阳性率。模式的选择根据具体情况而定，如受体的特性、药物的作用机制、检测试剂的可获得性、抗药抗体的亲和力、中和活性抗体的中和活性等等。此外，ro检测方法开发还需要考虑许多其他因素，如靶细胞亚群的数量，如果数量较少会增加方法开发的难度；以及靶抗原的表达丰度，如果表达丰度不高，对方法的稳健性也会带来挑战。因此在ro的方法开发中需要尝试多种检测模式，进行多种优化和验证，以保证方法的稳健性和可靠性。

3、双靶点药物(如双抗药物和抗体配体蛋白药物)的研制和应用越来越受重视，因此开发用于双靶点药物的ro检测方法具有重要的意义。

技术实现思路

1、第一方面，本申请提供了用于检测双靶点药物的第一靶点受体占有率的方法，其中所述双靶点药物包含靶向第一靶点的第一结合部和靶向第二靶点的第二结合部，所述第一靶点和所述第二靶点为免疫细胞表面表达的蛋白，所述方法包括：

2、将所述双靶点药物以一个或多个浓度加入全血样品中进行孵育；

3、加入结合所述第二结合部的带有可检测标记的第一检测试剂，所述第二结合部与所述第一检测试剂的亲和力足以阻断或夺取所述第二结合部与所述第二靶点的结合；

4、以单个细胞为检测单元，检测表达所述第一靶点的免疫细胞的可检测标记的信号强度，并基于各个细胞的信号强度值计算所述一个或多个浓度所对应的一个或多个测试中位数；

5、通过将所述一个或多个测试中位数与总信号强度中位数比较来确定所述双靶点药物的第一靶点受体占有率，其中所述总信号强度中位数是通过上述步骤，在加入所述双靶点药物的量足以饱和式结合免疫细胞上的第一靶点的条件下测定的中位数。

6、在第一方面的一些实施方案中，所述第一靶点为cd40；和/或所述第二靶点为cd137。

7、在第一方面的一些实施方案中，表达所述第一靶点的免疫细胞为b细胞；所述第一结合部为cd40的配体或其片段；和/或所述第二结合部为抗cd137抗体。

8、在第一方面的一些实施方案中，所述第一检测试剂为抗抗cd137抗体的中和活性抗体；所述第一检测试剂的浓度为100 μg/ml；所述可检测标记为生物素标记或荧光标记；和/或所述信号强度为荧光信号强度。

9、在第一方面的一些实施方案中，所述方法还包括：在所述双靶点药物与所述全血样品孵育结束后，加入红细胞裂解液进行红细胞裂解；和/或红细胞裂解结束后，离心收集细胞沉淀。

10、在第一方面的一些实施方案中，所述红细胞裂解液体积为所述全血体积的25-30倍。

11、在第一方面的一些实施方案中，所述方法还包括加入第二检测试剂。

12、在第一方面的一些实施方案中，所述第二检测试剂包含pe标记的链霉亲和素。

13、在第一方面的一些实施方案中，所述第二结合部与所述第一检测试剂的亲和力比所述第二结合部与所述第二靶点的亲和力高5000-20000倍。

14、第二方面，本申请提供了用于检测双靶点药物的第一靶点受体占有率的试剂盒，其中所述双靶点药物包含靶向第一靶点的第一结合部和靶向第二靶点的第二结合部，所述第一靶点和所述第二靶点为免疫细胞表面表达的蛋白，所述试剂盒包括：结合所述第二结合部的带有可检测标记的第一检测试剂；

15、其中所述第二结合部与所述第一检测试剂的亲和力足以阻断或夺取所述第二结合部与所述第二靶点的结合。

16、在第二方面的一些实施方案中，所述试剂盒还包括使用说明书。

17、在第二方面的一些实施方案中，所述第一靶点为cd40；和/或所述第二靶点为cd137。

18、在第二方面的一些实施方案中，所述表达第一靶点的免疫细胞为b细胞；所述第一结合部为cd40的配体或其片段；和/或所述第二结合部为抗cd137抗体。

19、在第二方面的一些实施方案中，所述第一检测试剂为抗抗cd137抗体的中和活性抗体。

20、在第二方面的一些实施方案中，所述可检测标记为生物素标记或荧光标记。

21、在第二方面的一些实施方案中，所述试剂盒还包括红细胞裂解液、和/或第二检测试剂。

22、在第二方面的一些实施方案中，所述第二检测试剂包含pe标记的链霉亲和素。

23、在第二方面的一些实施方案中，所述第二结合部与所述第一检测试剂的亲和力比所述第二结合部与所述第二靶点的亲和力高5000-20000倍。

技术特征：

1.用于检测双靶点药物的第一靶点受体占有率的方法，其中所述双靶点药物包含靶向第一靶点的第一结合部和靶向第二靶点的第二结合部，所述第一靶点和所述第二靶点为免疫细胞表面表达的蛋白，所述方法包括：

2.如权利要求1所述的方法，其中

3.如权利要求1所述的方法，其中

4.如权利要求3所述的方法，其中

5. 如权利要求1所述的方法，其中所述方法还包括：

6.如权利要求5所述的方法，其中

7.如权利要求4所述的方法，其中所述方法还包括加入第二检测试剂。

8.如权利要求7所述的方法，其中所述第二检测试剂包含pe标记的链霉亲和素。

9.如权利要求1所述的方法，其中所述第二结合部与所述第一检测试剂的亲和力比所述第二结合部与所述第二靶点的亲和力高5000-20000倍。

10.如权利要求1所述的方法，其中所述第二结合部与所述第一检测试剂的亲和力比所述第二结合部与所述第二靶点的亲和力高10000倍。

技术总结
本申请提供了用于检测双靶点药物的第一靶点受体占有率的方法，其中所述双靶点药物包含靶向第一靶点的第一结合部和靶向第二靶点的第二结合部，所述第一靶点和所述第二靶点为免疫细胞表面表达的蛋白。

技术研发人员：刘立月,刘运龙,欧伦,邹微微,武丽华
受保护的技术使用者：军科正源（北京）药物研究有限责任公司
技术研发日：
技术公布日：2024/1/13