本发明涉及生物医药,特别涉及一种含有ptk-7蛋白的外泌体的检测方法。
背景技术:
1、外泌体(exosome)是一种由细胞分泌的、大小介于30-150nm之间的膜性细胞外囊泡,其广泛存在于血液、尿液、唾液、乳汁、细胞培养液等多种介质中。已有研究发现,一些肿瘤组织分泌的外泌体数量会比正常组织明显增多,当样品中的外泌体数量增多时,可能暗示着某种疾病的发生,因此外泌体的检测至关重要。外泌体的检测分析在疾病早期诊断中的应用已成为研究热点,并表现出无创、易获取、检测便捷等优点,在精准医疗中日益受关注。当前,对外泌体的检测分析具有重大的意义。
2、蛋白酪氨酸激酶7(ptk-7)是wnt通路中的一种受体酪氨酸激酶,参与多种细胞间交流的过程。ptk-7蛋白在许多人类癌症中表达上调,如结肠癌、肺癌、胃癌和急性髓性白血病等。目前研究发现,ptk-7蛋白在乳腺癌细胞(mcf-7cell)和人急性淋巴细胞白血病t淋巴细胞(ccrf-cem cell)分泌的外泌体中表达增高,被认为是疾病诊断的生物标志物之一。因此,ptk-7蛋白的检测对于癌症的早期诊断和愈后监测具有重要意义。
3、然而,由于外泌体的大小约为30-150nm,密度也相对较小,比蛋白质大而又远小于微米级的细胞,这使得其检测分析具有一定的挑战性。近年来,各种分析技术已经用于外泌体的分析,但这些方法往往需要较长的时间、昂贵的仪器和复杂的操作。如蛋白质印迹法(wb)外泌体中一些标志物蛋白的测定,存在操作繁琐、耗时、难准确定量等问题。因此,仍迫切需要开发高效、快速、简便、可靠的检测方法。
技术实现思路
1、针对现有技术的不足,本发明提供了一种含有ptk-7蛋白的外泌体的检测方法,利用二苯乙烯类化合物和核酸适配体的特点,建立了一种新型的外泌体检测方法,可为今后肿瘤疾病的早期筛查、疗效监测和愈后监测带来新的启发。
2、为解决上述技术问题,本发明的目的是提供一种含有ptk-7蛋白的外泌体的检测方法,至少包括以下步骤:
3、s1、制备sits-ptk-7核酸适配体传感器;
4、s2、sits-ptk-7核酸适配体传感器上的适配体与一系列不同数量的外泌体表面的ptk-7蛋白特异性结合后,进行荧光衰减检测,并计算表观荧光衰减速率kapp值;根据外泌体数量和kapp值绘制sits-ptk-7核酸适配体传感器检测不同数量外泌体的标准曲线,对外泌体进行检测分析。
5、通过上述技术方案,二苯乙烯类化合物具有光致异构化特性,可实现基于荧光衰减的检测模式。二苯乙烯分子具有顺式(非荧光)和反式(荧光)两种光学异构体,在特定波长的持续紫外光照下,由于二苯乙烯分子的顺反异构,可产生荧光衰减的现象。此顺反异构为可逆反应,这赋予了二苯乙烯类化合物作为可再生信号分子的天然特点。此外,已知分子周围的微环境是影响二苯乙烯顺反光异构化的一个重要因素。因此,根据其光学异构导致荧光持续衰减以及其对分子周围环境敏感的特性,可将二苯乙烯类化合物与生物识别元件(例如核酸适配体)联结,利用生物识别时产生的理化变化改变二苯乙烯光学的异构化进程,从而由衰减曲线的变化反映目标物的含量。此独特的检测模式理论上不会受到背景荧光强度的影响,并且可以避免繁杂的分离和洗涤步骤。
6、进一步地,所述荧光衰减检测的检测条件为:激发波长ex为280-380nm,发射波长em为380-480nm。
7、进一步地,所述sits-ptk-7核酸适配体传感器的合成步骤为,用碳酸钠-碳酸氢钠缓冲溶液溶解的sits与ptk-7核酸适配体溶液以(10-1000):1的比例混合均匀;在室温、避光条件下,400-1000r/min搅拌6-48h后,超滤纯化3-20次,得到产物sits-ptk-7核酸适配体传感器。
8、进一步地,所述超滤纯化步骤为,将反应物转移到超滤离心管中,5000-20000×g,4-30℃,离心5-60min,用以除去未反应的sits。
9、进一步地,所述碳酸钠-碳酸氢钠缓冲溶液的浓度为0.01-1m,其中碳酸钠与碳酸氢钠的质量比为(2:8)-(8:2)。
10、进一步地,所述ptk-7核酸适配体的序列包括(atctaactgctgcgccgccgggaaaatactgtacggttaga)。
11、进一步地,所述sits-ptk-7核酸适配体传感器上的适配体与外泌体结合步骤为,用pbs溶液配制浓度为0.05-10μm的sits-ptk-7核酸适配体传感器溶液后,加入一系列不同数量的外泌体;继续用pbs溶液稀释,配制得到浓度为0.01-4μm的sits-ptk-7核酸适配体传感器溶液。
12、进一步地,将浓度为0.01-4μm的sits-ptk-7核酸适配体传感器溶液在室温避光条件下放置1-60min后,即可进行荧光衰减检测。
13、进一步地,所述外泌体源于肿瘤细胞,根据荧光动力学对肿瘤细胞的外泌体进行检测分析。
14、进一步地,所述含有ptk-7蛋白的外泌体提取自乳腺癌细胞。
15、本发明的有益效果:
16、(1)本发明的技术方案中,基于外泌体纳米级生物标记物的特点,本发明利用核酸适配体的适应性配体结合和二苯乙烯类化合物的荧光衰减的独特优点,开发一种独特的基于荧光衰减适配体传感器的外泌体检测新方法。
17、(2)该种新的检测方法基于动力学的传感模式,理论上不受背景荧光的干扰,不需要复杂的分析分离步骤,有望克服传统静态荧光模式的存在的一些问题。此外,基于二苯乙烯类化合物顺反异构的可逆性,还可能实现适配体传感器的循环再生,提高利用率。由于核酸适配体由指数富集的配体进化(selex)技术体外筛选得到的,理论上可以通过不断筛选得到目标适配体。而且核酸适配体结构相对简单,所开发的传感策略可以较易地应用到其他核酸适配体当中。
18、(3)本发明期望建立一种全新的基于荧光衰减的肿瘤外泌体检测方法,为肿瘤疾病的早期筛查、疗效监测和愈后监测等提供新思路和有力支持。
1.一种含有ptk-7蛋白的外泌体的检测方法,其特征在于,至少包括以下步骤:
2.根据权利要求1所述的一种含有ptk-7蛋白的外泌体的检测方法,其特征在于:所述荧光衰减检测的检测条件为:激发波长ex为280-380nm,发射波长em为380-480nm。
3.根据权利要求1所述的一种含有ptk-7蛋白的外泌体的检测方法,其特征在于:所述sits-ptk-7核酸适配体传感器的合成步骤为,用碳酸钠-碳酸氢钠缓冲溶液溶解的sits与ptk-7核酸适配体溶液以(10-1000):1的比例混合均匀;在室温、避光条件下,400-1000r/min搅拌6-48h后,超滤纯化3-20次,得到产物sits-ptk-7核酸适配体传感器。
4.根据权利要求3所述的一种含有ptk-7蛋白的外泌体的检测方法,其特征在于:所述超滤纯化步骤为,将反应物转移到超滤离心管中,5000-20000×g,4-30℃,离心5-60min,用以除去未反应的sits。
5.根据权利要求3所述的一种含有ptk-7蛋白的外泌体的检测方法,其特征在于:所述碳酸钠-碳酸氢钠缓冲溶液的浓度为0.01-1m,其中碳酸钠与碳酸氢钠的质量比为(2:8)-(8:2)。
6.根据权利要求3所述的一种含有ptk-7蛋白的外泌体的检测方法,其特征在于:所述ptk-7核酸适配体的序列包括(atctaactgctgcgccgccgggaaaatactgtacggttaga)。
7.根据权利要求1所述的一种含有ptk-7蛋白的外泌体的检测方法,其特征在于:所述sits-ptk-7核酸适配体传感器上的适配体与外泌体结合步骤为,用pbs溶液配制浓度为0.05-10μm的sits-ptk-7核酸适配体传感器溶液后,加入一系列不同数量的外泌体;继续用pbs溶液稀释,配制得到浓度为0.01-4μm的sits-ptk-7核酸适配体传感器溶液。
8.根据权利要求7所述的一种含有ptk-7蛋白的外泌体的检测方法,其特征在于:将浓度为0.01-4μm的sits-ptk-7核酸适配体传感器溶液在室温避光条件下放置1-60min后,即可进行荧光衰减检测。
9.根据权利要求1所述的一种含有ptk-7蛋白的外泌体的检测方法,其特征在于:所述外泌体源于肿瘤细胞,根据荧光动力学对肿瘤细胞的外泌体进行检测分析。
10.根据权利要求1所述的一种含有ptk-7蛋白的外泌体的检测方法,其特征在于:所述含有ptk-7蛋白的外泌体提取自乳腺癌细胞。