一种细胞衰老的荧光标记方法、试剂及应用

本发明属于生物，涉及一种荧光标记方法，具体涉及一种细胞衰老的荧光标记方法、试剂及应用。

背景技术：

1、伴随社会经济的发展，我国正面临人口老龄化的问题，衰老和衰老相关疾病的预防和机制研究成为研究的重点。作为衰老的主要标志之一，细胞衰老是引起整体衰老并促进衰老相关疾病发生发展的重要环节。因此，在活体水平上对细胞衰老进行识别和标记成像是推动衰老和衰老相关疾病研究的基础且必要的手段。

2、在对细胞衰老的机制研究中，衰老相关的β-半乳糖苷酶(senescence associatedβ-galactosidase；sa-β-gal)的活性升高是最基本且主要的表型，表现为利用β-半乳糖苷酶催化底物x-gal产生蓝色产物，从而识别标记衰老的细胞。但是，sa-β-gal的标记方法需要对细胞或组织进行固定处理，无法实现活细胞以及活体水平的细胞衰老标记能力。

技术实现思路

1、本发明的目的是提供一种细胞衰老的荧光标记方法及试剂，以解决上述现有技术存在的问题，首次通过活体荧光标记方法对肿瘤治疗过程中的细胞衰老及衰老细胞清除的过程实现细胞衰老的活体荧光标记成像，解决了经典染色方法无法应用于活体的限制。这能够为衰老和衰老相关疾病的预防和机制研究提供一种新的活体荧光成像手段。

2、为实验上述目的，本发明采用的技术方案如下：

3、第一方面，本申请实施例提供一种细胞衰老的荧光标记方法，包括：

4、将β-半乳糖苷酶响应性喹啉丙二腈荧光分子与完全培养基充分混合，与待检测细胞共培养后进行荧光成像，于荧光显微镜下观察。

5、进一步地，所述共培养具体为：将β-半乳糖苷酶响应性喹啉丙二腈荧光分子以二甲基亚砜为溶剂配成10mm的原液，用于细胞培养时用完全培养基稀释配制到终浓度为10μm，培养时间为1小时。

6、第二方面，本申请实施例提供一种细胞衰老的荧光标记方法，用于活体动物，包括：

7、采用β-半乳糖苷酶响应性喹啉丙二腈荧光分子静脉注射；

8、通过荧光成像方法来检测和标记活体动物组织中的细胞衰老；

9、或用于对活体动物组织中细胞衰老进行标记追踪。

10、进一步地，静脉注射所采用的是将β-半乳糖苷酶响应性喹啉丙二腈荧光分子先溶于一份体积的二甲基亚砜，再加入一份体积的蓖麻油聚氧乙烯醚混匀，再加入十八份体积的生理盐水经超声振荡混匀，形成稳定均一的溶液。

11、进一步地，所采用的荧光成像方法是将活体光纤共聚焦显微镜的光纤探头插入活体动物组织内部进行488nm激光激发下的荧光信号采集，过程中活体动物需要以异氟烷进行气体麻醉维持。

12、进一步地，将荧光分子静脉注射后能够实现活体水平细胞衰老的至少14天的长时间标记追踪。

13、第三方面，本申请实施例提供一种用于细胞衰老荧光成像的试剂，用于与活细胞共培养以标记衰老细胞，所述试剂为溶液，具体为：取固体的β-半乳糖苷酶响应的喹啉丙二腈荧光分子溶于二甲基亚砜，配制成10mm原液，后用完全培养基稀释配制成10um工作浓度。

14、第四方面，本申请实施例提供一种用于活体动物细胞衰老成像的试剂，用于静脉注射入活体动物组织中以标记衰老细胞，所述试剂为溶液，具体为：取固体的β-半乳糖苷酶响应的喹啉丙二腈荧光分子溶于二甲基亚砜，浓度为20mm，加入与二甲基亚砜等体积的蓖麻油聚氧乙烯醚混匀，再加入十八倍体积的生理盐水混匀并超声振荡，最终的工作浓度为1mm。

15、第五方面，本申请实施例提供一种衰老细胞清除药物清除效果评估方法，该方法为对活体动物施加衰老细胞清除药物后，采用上述任一种所述的方法检测衰老细胞数量。

16、本发明的有益效果是：

17、本发明利用β-半乳糖苷酶响应的喹啉丙二腈荧光分子可以对细胞衰老进行荧光标记，并进一步用于活体的细胞衰老的长时间荧光标记和追踪，操作简便，易于推广，可以应用于对荷瘤动物的肿瘤细胞衰老以及衰老细胞清除药物的清除效果进行检测和评估，本发明能够为衰老和衰老相关疾病的预防和机制研究提供一种新的活体荧光标记方法。

技术特征：

1.一种细胞衰老的荧光标记方法，其特征在于，包括：

2.根据权利要求1所述的细胞衰老的荧光标记方法，其特征在于，所述共培养具体为：将β-半乳糖苷酶响应性喹啉丙二腈荧光分子以二甲基亚砜为溶剂配成10mm的原液，用于细胞培养时用完全培养基稀释配制到终浓度为10μm，培养时间为1小时。

3.一种细胞衰老的荧光标记方法，其特征在于，用于活体动物，包括：

4.权利要求1所述的荧光标记方法，其特征在于，静脉注射所采用的是将β-半乳糖苷酶响应性喹啉丙二腈荧光分子先溶于一份体积的二甲基亚砜，再加入一份体积的蓖麻油聚氧乙烯醚混匀，再加入十八份体积的生理盐水经超声振荡混匀，形成稳定均一的溶液。

5.权利要求1所述的荧光标记方法，其特征在于，所采用的荧光成像方法是将活体光纤共聚焦显微镜的光纤探头插入活体动物组织内部进行488nm激光激发下的荧光信号采集，过程中活体动物需要以异氟烷进行气体麻醉维持。

6.权利要求1所述的荧光标记方法，其特征在于，将荧光分子静脉注射后能够实现活体水平细胞衰老的至少14天的长时间标记追踪。

7.一种用于细胞衰老荧光成像的试剂，其特征在于，用于与活细胞共培养以标记衰老细胞，所述试剂为溶液，具体为：取固体的β-半乳糖苷酶响应的喹啉丙二腈荧光分子溶于二甲基亚砜，配制成10mm原液，后用完全培养基稀释配制成10um工作浓度。

8.一种用于活体动物细胞衰老成像的试剂，其特征在于，用于静脉注射入活体动物组织中以标记衰老细胞，所述试剂为溶液，具体为：取固体的β-半乳糖苷酶响应的喹啉丙二腈荧光分子溶于二甲基亚砜，浓度为20mm，加入与二甲基亚砜等体积的蓖麻油聚氧乙烯醚混匀，再加入十八倍体积的生理盐水混匀并超声振荡，最终的工作浓度为1mm。

9.一种衰老细胞清除药物的清除效果评估方法，其特征在于，对活体动物施加衰老细胞清除药物后，采用如权利要求3-6任一项所述的方法检测衰老细胞数量。

技术总结
本发明公开了一种细胞衰老的荧光标记方法、试剂及应用，所述方法包括：采用β‑半乳糖苷酶响应性喹啉丙二腈荧光分子孵育衰老细胞，通过荧光成像的方法来检测和识别衰老细胞。尤其是可以将所述荧光分子进一步用来检测和标记活体动物组织中的细胞衰老，可以将其应用于促衰老联合衰老细胞裂解治疗过程中的细胞衰老的活体长时间标记追踪，如：肿瘤化疗过程中发生细胞衰老的荧光成像以及在此基础上叠加衰老细胞清除药物监测细胞衰老的清除过程。本发明首次采用β‑半乳糖苷酶响应性喹啉丙二腈荧光分子用于细胞衰老的荧光标记，并实现活体水平的肿瘤治疗过程中细胞衰老的长时间标记追踪，为评价细胞衰老提供一种全新的荧光标记方法。

技术研发人员：田梅,张宏,岑沛立
受保护的技术使用者：浙江大学
技术研发日：
技术公布日：2024/1/15