一种基于重组蛋白A的双重定向偶联免疫探针的制备方法

本发明属于食品安全检测和医学检验领域，具体涉及一种在纳米粒子表面定向偶联重组蛋白a进而定向偶联抗体的双重定向偶联免疫探针的制备方法。

背景技术：

1、蛋白a(protein a，pa)是一种金黄色葡萄球菌细胞壁蛋白质，能够特异性地结合多种免疫球蛋白的fc区段。天然的蛋白a有5个igg结合结构域和未知功能的非fc结合域。此结构的蛋白a大量结合igg的同时，其非fc结合域会结合部分杂蛋白。重组蛋白a(recombinant protein a，rpa)是根据野生型蛋白a的序列信息，设计筛选获得稳定性及产量较优蛋白a，由大肠杆菌表达，经镍柱纯化获得，纯度大于95％，可耐受0.5m的naoh和0.5m的hcl处理，不降解、抗体结合能力不变，并且不结合其他杂蛋白。rpa可结合大多数人或小鼠免疫球蛋白子类(如人igg1、igg2、igg4；小鼠igg2、igg2a、igg2b、igg3)，还可结合牛、猪、仓鼠、兔的总免疫球蛋白。rpa的c末端修饰有半胱氨酸，可定向偶联到材料表面，提高材料表面fc结合位点密度。与半胱氨酸的巯基残基反应的常用策略有碘乙酰基团、3-溴乙烯基团的卤素取代反应，和巯基与马来酰亚胺的加成反应；但组氨酸的咪唑基侧链和甲硫氨酸的硫醚残基同样可与碘和溴发生卤素取代反应，而巯基的加成反应速度较慢，反应过程中巯基会自氧化形成双硫键，需要小心控制。

2、表面羧基化或氨基化的纳米粒子需要通过羧基和氨基的共价连接完成与抗体的偶联，1-乙基-3-(3-二甲基氨基丙基)碳二亚胺盐酸盐(edc)是常用的反应活化剂。然而，纳米粒子和抗体通过羧基和氨基的共价连接得到的免疫探针，其表面的抗体伸展方向是随机的；大部分抗体存在多个氨基和羧基残基，容易产生纳米粒子和抗体的相互交联进而引发不可逆聚集；共价偶联过程中会影响抗体活性。

3、基于上述情况，发明人研究开发了一种利用rpa的c端半胱氨酸巯基与纳米粒子表面氯乙酰基团发生取代反应，将rpa定向偶联到纳米粒子表面，进而定向偶联抗体的双重定向偶联免疫探针的制备方法，目前，尚未有纳米粒子使用该偶联方式进行定向偶联并应用的相关报道。

技术实现思路

1、本发明旨在提供一种基于重组蛋白a的双重定向偶联免疫探针的制备方法，该制备方法具有高效、易于制备、重复性良好的优点，制备得到定向偶联rpa的纳米粒子分散性好，可实现抗体的定向偶联，提高抗体利用效率和免疫探针识别性能。

2、为了实现上述目的，本发明采取的技术方案如下：

3、本发明提供了一种重组蛋白a(rpa)的双重定向偶联免疫探针的制备方法，包括如下步骤：

4、对于表面羧基化的纳米粒子，将纳米粒子作为信号输出材料，分散于ph＝6的0.01m4-吗啉乙磺酸(mes)缓冲体系中，加入2-氯乙酰肼盐酸盐和碳二亚胺edc于室温反应90min，随后加入0.1m甘氨酸淬灭剩余的edc和活化羧基位点，离心后将沉积物重悬于0.1m的碳酸氢钠溶液中；随后加入经三(2-羧乙基)膦(tcep)预处理的rpa室温反应60min，随后用0.1m半胱氨酸淬灭剩余的氯取代反应位点，离心后将沉积物重悬于0.01m tris缓冲液中，即制得定向偶联rpa的纳米粒子。

5、对于表面氨基化的纳米粒子，将纳米粒子作为信号输出材料，分散于四氢呋喃(thf)溶剂中，加入三乙胺，逐滴加入氯乙酰氯反应120min，离心后将沉积物重悬于0.1m的碳酸氢钠溶液中；后续修饰反应同表面羧基化的纳米粒子相同。

6、对于表面羟基化的纳米粒子，制备方法与表面氨基化的纳米粒子相同。

7、得到定向偶联rpa的纳米粒子后，在ph为7.5～8.0的缓冲液中结合抗体，形成双重定向偶联免疫探针。

8、进一步的，所述定向偶联rpa的纳米粒子的制备方法中，表面羧基化的纳米粒子连接臂2-氯乙酰肼盐酸盐添加浓度控制在50～250mg/g；表面氨基化和羟基化的纳米粒子连接臂氯乙酰氯添加浓度控制在20～100mg/g。

9、进一步的，所述定向偶联rpa的纳米粒子的制备方法中，rpa需5mm tcep预处理30-60min。

10、进一步的，所述定向偶联rpa的纳米粒子的制备方法中，rpa添加浓度控制在50～300mg/g。

11、进一步的，所述定向偶联rpa的纳米粒子的制备方法中，rpa于纳米粒子反应体系为0.1m碳酸氢钠溶液。

12、进一步的，所述双重定向偶联免疫探针的制备方法中，定向偶联rpa的纳米粒子结合抗体的缓冲ph为7.5～8.0。

13、本发明还包括上述方法制得的重组蛋白a的双重定向偶联免疫探针。

14、本发明的有益效果是：

15、1、本发明提供的方法，通过连接臂将重组蛋白a定向偶联于纳米粒子表面，简单高效，提高纳米粒子表面抗体fc片段结合位点的密度，不影响信号输出，不影响抗体结合活性，直接应用于抗体的识别。

16、2、本发明首次使用了氯乙酰基团与重组蛋白a的巯基残基反应用于定向偶联，能避免卤素取代位置与组氨酸、甲硫氨酸的副反应。

17、3、本发明修饰纳米粒子表面使用的氯乙酰肼和氯乙酰氯为异型双功能偶联剂，可避免纳米粒子共价偶联时与蛋白产生交联引发聚集。

18、4、本发明使用的双重定向偶联能提高抗体的使用效率，进一步提高所得免疫探针对抗原的亲和作用。

技术特征：

1.一种基于重组蛋白a的双重定向偶联免疫探针的制备方法，其特征在于，在纳米粒子表面修饰氯乙酰基团，与重组蛋白a的c端半胱氨酸巯基发生取代反应，定向偶联重组蛋白a；再经重组蛋白a定向结合抗体fc片段，制得双重定向偶联免疫探针。

2.根据权利要求1所述的一种基于重组蛋白a的双重定向偶联免疫探针的制备方法，其特征在于，所述纳米粒子为表面羧基化或氨基化或羟基化的纳米粒子。

3.根据权利要求1或2所述的一种基于重组蛋白a的双重定向偶联免疫探针的制备方法，其特征在于，所述制备方法包括如下步骤：

4.根据权利要求3所述的一种基于重组蛋白a的双重定向偶联免疫探针的制备方法，其特征在于，所述步骤(1)中在表面羧基化的纳米粒子表面修饰氯乙酰基团时，连接臂2-氯乙酰肼盐酸盐添加浓度控制在50～250mg/g；在表面氨基化和羟基化的纳米粒子表面修饰氯乙酰基团时，连接臂氯乙酰氯添加浓度控制在20～100mg/g。

5.根据权利要求3所述的一种基于重组蛋白a的双重定向偶联免疫探针的制备方法，其特征在于，所述步骤(2)中，重组蛋白a在5mm tcep预处理30-60min。

6.根据权利要求3所述的一种基于重组蛋白a的双重定向偶联免疫探针的制备方法，其特征在于，所述步骤(2)中，重组蛋白a添加浓度控制在50～300mg/g。

7.根据权利要求3所述的一种基于重组蛋白a的双重定向偶联免疫探针的制备方法，其特征在于，所述步骤(2)中，重组蛋白a与纳米粒子反应体系为0.1m碳酸氢钠溶液。

8.根据权利要求3所述的一种基于重组蛋白a的双重定向偶联免疫探针的制备方法，其特征在于，所述步骤(3)中，定向偶联重组蛋白a的纳米粒子结合抗体的缓冲液ph为7.5～8.0。

9.权利要求1至8任意一项所述制备方法制得的基于重组蛋白a的双重定向偶联免疫探针。

技术总结
本发明公开了一种基于重组蛋白A的双重定向偶联免疫探针制备方法。通过在表面羧基化或氨基化或羟基化的纳米粒子表面修饰氯乙酰基团，与重组蛋白A的C端半胱氨酸巯基进行取代反应，定向偶联重组蛋白A；再经重组蛋白A对抗体Fc片段特异性结合进行抗体的定向偶联。本发明定向偶联重组蛋白A能提高纳米粒子表面Fc片段结合位点密度，提高抗体使用效率、避免纳米粒子与抗体交联聚集，进而提高所得免疫探针对抗原的亲和作用，具有良好的应用前景。

技术研发人员：赖卫华,胡立文,彭娟,熊勇华,魏华,黄小林
受保护的技术使用者：南昌大学
技术研发日：
技术公布日：2024/1/15