甘胆酸抗原、抗体、检测试剂制备方法及检测方法与流程

本发明涉及医学检验，尤其涉及一种甘胆酸抗原、抗体、检测试剂制备方法及检测方法。

背景技术：

1、正常情况下，人体外周血中的甘胆酸浓度都稳定在低水平，而当人体干细胞受损或胆汁淤积时，会引起甘胆酸代谢和循环紊乱，使肝细胞摄取甘胆酸的能力下降，导致血液中甘胆酸含量升高，甘胆酸值高低还与肝细胞损害及胆汁酸代谢障碍的严重程度相关，血液中甘胆酸值可以评价人体健康。目前临床上应用的甘胆酸检测方法主要为均相酶免疫法、化学发光法、免疫比浊法。其中均相酶免疫法简单快速，但稳定性差。化学发光法灵敏度高，但同样存在稳定性差，且标记工序繁琐，制作成本高。免疫比浊法检测速度快、成本低，但由于抗体与小分子直接结合无法形成浊度，灵敏度偏低，需采用竞争法。

2、现有公开号为cn113721012a、cn105481977a、cn112285345a、cn109444399a公开的甘胆酸检测试剂(胶乳免疫比浊法)，竞争物为甘胆酸-蛋白或甘胆酸-蛋白-微球。

3、但是，上述甘胆酸检测试剂(胶乳免疫比浊法)制备过程较为繁琐，且试剂测定结果可能会受到甘胆酸类似物的干扰，甘胆酸类似物有胆酸钠、甘氨熊脱氧胆酸、甘氨鹅脱氧胆酸、甘氨脱氧胆酸等。

技术实现思路

1、本发明的目的在于提供一种甘胆酸抗原、抗体、检测试剂制备方法及检测方法，解决了上述甘胆酸检测试剂(胶乳免疫比浊法)制备过程较为繁琐，且试剂测定结果可能会受到甘胆酸类似物的干扰的问题。

2、为实现上述目的，本发明提供了一种甘胆酸检测试剂制备方法，包括以下步骤：

3、制备试剂r1，其中，所述试剂r1包括磷酸氢二钠6g/l，磷酸二氢钠1g/l，氯化钠5～9g/l，2.5～5g/l吐温-20，叠氮化钠1g/l，edta·2na1～2g/l，抗甘胆酸抗体0.65g/l，葡聚糖1g/l和peg600030g/l；

4、制备试剂r2；

5、制备标准品；

6、将所述试剂r1、所述试剂r2和所述标准品组合，获得甘胆酸检测试剂。

7、其中，制备试剂r2，所述方法还包括：

8、按1ml10％固含量胶乳加纯化水稀释至5％固含量，在磁力搅拌器上搅拌均匀；

9、按每毫升胶乳加入0.015g的1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺和n-羟基琥珀酰亚胺，磁力搅拌反应30分钟；

10、按每毫升胶乳加入10～12mg甘胆酸抗原，并磁力搅拌反应2.5小时；

11、反应完成后，按每毫升胶乳加入适量封闭液，并磁力搅拌反应2小时，反应完毕后，即完成包被；

12、取包被完成的致敏胶乳，用1.5ml离心管分装，进行12000rpm，4℃离心30分钟；

13、超声稀释后获得所述试剂r2。

14、其中，制备标准品，所述方法还包括：

15、称取适量甘氨胆酸水合物溶于pbs缓冲液中，配成浓度为80mg/l高浓度校准品，并对倍稀释，获得各点校准品。

16、一种甘胆酸抗原制备方法，包括以下步骤：

17、将51mg固体甘胆酸完全溶解于1.5ml二甲基甲酰胺溶液中；

18、向溶液中分别加入1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺28.76mg和n-羟基琥珀酰亚胺17.25mg，并在室温下避光搅拌过夜；

19、在4℃，1000rpm，离心10min分离得到的上清液；

20、将5.5μmol牛血清白蛋白或鸡卵清白蛋白用纯化水溶解至10mg/ml左右并逐滴加入，室温下搅拌反应4h，偶联反应后，将溶液完全装入透析袋中，置于pbs缓冲液中进行透析；

21、在4℃透析3天，以每天两次更换未结合的甘胆酸，所得的复合物甘胆酸-牛血清白蛋白用作抗原，甘胆酸-鸡卵清白蛋白作为包被抗原。

22、一种抗体制备方法，包括以下步骤：

23、用pbs缓冲液将合成的甘胆酸-牛血清白蛋白抗原稀释至1mg/ml，得到抗原溶液；

24、用1.0ml抗原溶液与弗式完全佐剂进行混合，对实验动物兔进行初次免疫；

25、初次免疫后，再用1.0ml相同的抗原溶液与弗式不完全佐剂进行加强免疫，间隔10～14天，再经2～3次以上的加强免疫；

26、对动物进行血清采集，并进行抗血清滴度测定，达到理想滴度后，分离纯化获得抗甘胆酸抗体。

27、一种甘胆酸检测方法，包括以下步骤：

28、向6μl甘胆酸检测样品中加入160μl的甘胆酸试剂r1，混匀，在37℃孵育2分钟；

29、加入80μl试剂r2，混匀，37℃孵育约30秒后，读取吸光度值a1，孵育约5分钟，读取吸光度值a2；

30、计算两次吸光度变化值，进而计算出样品中的甘胆酸的浓度。

31、本发明的一种甘胆酸抗原、抗体、检测试剂制备方法及检测方法，检测试剂中含有试剂r1、试剂r2和校准品，试剂r1含有抗甘胆酸抗体，r2中含有甘胆酸-载体蛋白复合物，检测过程中，样本中的甘胆酸小分子与试剂r2中的甘胆酸-载体蛋白复合物竞争结合试剂r1中的甘胆酸抗体，反应度与样本中的甘胆酸浓度成反比，甘胆酸浓度越高，反应度越低，通过测定600nm处的吸光度，建立校准曲线，计算血清样本中甘胆酸的浓度，试剂r1中获得的甘胆酸抗体采用的是甘胆酸-牛血清白蛋白免疫原，试剂r2中采用的是甘胆酸-鸡卵清白蛋白包被抗原，设定试剂r1和试剂r2中含有的抗原不同，这样与样本反应产生的信号值完全是由抗甘胆酸抗体与包被抗原反应得到，并通过添加硫酸葡聚糖进一步提高试剂抗干扰能力，硫酸葡聚糖作为一种阻断剂，可以降低甘胆酸类似物干扰。直接利用甘胆酸小分子与载体蛋白进行偶联制备甘胆酸衍生物，进而免疫获得抗甘胆酸抗体，再利用抗体制作甘胆酸检测试剂，在整个过程制备简易，成本低廉，且灵敏度高，在体外诊断方面具有良好的应用价值。

技术特征：

1.一种甘胆酸检测试剂制备方法，其特征在于，包括以下步骤：

2.如权利要求1所述的甘胆酸检测试剂制备方法，其特征在于，制备试剂r2，所述方法还包括：

3.如权利要求1所述的甘胆酸检测试剂制备方法，其特征在于，制备标准品，所述方法还包括：

4.一种甘胆酸抗原制备方法，适用于如权利要求1所述的甘胆酸检测试剂制备方法，其特征在于，包括以下步骤：

5.一种抗体制备方法，适用于如权利要求4所述的甘胆酸抗原制备方法，其特征在于，包括以下步骤：

6.一种甘胆酸检测方法，适用于如权利要求5所述的抗甘胆酸抗体制备方法，其特征在于，包括以下步骤：

技术总结
本发明涉及医学检验技术领域，具体涉及一种甘胆酸抗原、抗体、检测试剂制备方法及检测方法，检测时，样本中的甘胆酸小分子与试剂R2中的甘胆酸‑载体蛋白复合物竞争结合试剂R1中的甘胆酸抗体，反应度与样本中的甘胆酸浓度成反比，甘胆酸浓度越高，反应度越低，通过测定600nm处的吸光度，建立校准曲线，计算血清样本中甘胆酸的浓度；并通过添加硫酸葡聚糖进一步提高试剂抗干扰能力，可以降低甘胆酸类似物干扰。在整个过程制备简易，成本低廉，且灵敏度高，在体外诊断方面具有良好的应用价值。

技术研发人员：苏钰清,苟文来
受保护的技术使用者：桂林优利特医疗电子有限公司
技术研发日：
技术公布日：2024/1/16