一种氨基酸类代谢物的高分辨液质联用分析方法及应用

本发明涉及植物代谢分析领域，具体为一种氨基酸类代谢物的高分辨液质联用分析方法及应用。

背景技术：

1、氨基酸是构成蛋白质分子的基本单位，是生物体不可缺少的营养成分，在生物体新陈代谢和生理过程中占有重要地位。作为植物体内主要代谢产物之一，除了参与蛋白质合成，氨基酸也是植物生长和胁迫适应中重要的标志性代谢物前体，植物对生物和非生物因素的反馈均会引起氨基酸水平的变化。此外，氨基酸还是能量和氮素代谢的核心成分，在能量代谢和众多活性化合物的产生中发挥重要作用。因此，氨基酸代谢对植物来说是一个至关重要的过程，对氨基酸类代谢物的检测分析、全面准确测定体内氨基酸代谢状态，在促进植物生长、进行正常代谢、维持生命活动方面具有重要意义。如何对复杂生物体氨基酸类代谢物进行快速筛查和准确鉴定，全面揭示机体氨基酸代谢网络的变化，依然是相关领域亟待解决的热点问题。

2、前期研究表明，对植物中氨基酸进行分析主要采用高效液相色谱法和色谱串联质谱法，这些方法通常测定的代谢物种类有限，测定过程繁琐，如气相色谱串联质谱法需要对样本进行衍生化处理再做分析。随着现代分析技术的发展，高分辨质谱技术因其通量高、分析速度快、质量精度和分辨率高等特点，以及可直接获得物质的准分子离子及特征碎片信息，成为复杂生物体内氨基酸类代谢物鉴定的最有效手段之一，结合相应数据库检索，在快速识别和高效注释该类成分方面具有明显优势。然而现有的公共质谱数据库来源众多，质量参差不齐，所涵盖的质谱信息不够完善，同时由于各实验室仪器类型、状态和数据采集方式不同，所采集的质谱信息和裂解规律较为分散，难以整合应用，导致鉴定结果的可信度低以及数据处理速度受影响。因此，亟需建立氨基酸类代谢物快速准确分析方法，扩展信息覆盖面，提高氨基酸类代谢物的高通量鉴定和注释，弥补现有不足。

技术实现思路

1、本发明的目的是针对以上问题提供一种利用高分辨液质联用技术快速筛查和准确鉴定氨基酸类代谢物的分析方法及其在高效定性和相对定量分析植物体内氨基酸类代谢物方面的应用。

2、为达到上述目的，本发明公开了一种氨基酸类代谢物的高分辨液质联用分析方法，所述分析方法包括如下步骤：

3、s11、有针对性筛选93种常见且重要的氨基酸类代谢物标准品，分别记录其基本信息，所述基本信息包括名称、分子式、cas id；

4、s12、标准品溶液配制：将各标准品分别与溶剂混合得到相应的标准品溶液；

5、s13、在色谱分离条件下，通过数据依赖型采集模式获取标准品溶液中目标化合物的高分辨质谱谱图，包括一级和二级离子碎片信息；

6、s14、将标准品基本信息、质谱谱图和离子碎片信息导入建库系统，构建氨基酸类代谢物的高分辨质谱数据库；

7、s15、获取生物体质谱数据，基于“一级定量+二级定性”原则，根据高分辨质谱数据库中化合物的二级特征碎片离子，对生物体氨基酸类代谢物进行快速筛查和准确鉴定，同步提取一级质谱峰面积进行相对定量分析。

8、优选地，步骤s12中，所述标准品溶液体系所使用的溶剂包括超纯水、0.1 m hcl和0.16% naoh的任意一种，浓度为5-10 μg/ml。

9、优选地，步骤s12中氨基酸类代谢物标准品溶液配制原则包括：选择精准分子量不相同的每10种标准品的单标储备液混合配制为混标储备液；若剩余有不足10种的精准分子量不相同的2种或2种以上标准品的单标储备液，也将其全部混合配制为混标储备液；以超纯水为溶剂，分别将各混标储备液稀释为5-10 μg/ml的混标工作液；精准分子量相同的标准品的单标储备液仍然保持单标形式，以超纯水为溶剂，分别将其稀释为5-10 μg/ml的单标工作液。

10、优选地，步骤s13中所使用的色谱柱为acquity hss t3超高效液相色谱柱，兼顾极性和非极性化合物分离。

11、优选地，步骤s13中所使用仪器为超高效液相色谱-四极杆-静电场轨道阱质谱。

12、优选地，步骤s13中碰撞能为10-100 ev。

13、优选地，以构建的高分辨质谱数据库中氨基酸类代谢物二级离子碎片信息作为定性依据。

14、本发明还公开了根据以上一种氨基酸类代谢物高分辨液质联用分析方法的应用，该应用步骤如下：

15、s21、对植物样本进行粗提，获得代谢物提取液；

16、s22、采用数据依赖型采集模式对样本代谢物提取液进行分离检测，得到相应质谱谱图数据，包括一级和二级离子碎片信息；

17、s23、将获得的高分辨质谱数据库导入compound discoverer软件中，同时导入采集的样本质谱谱图数据进行快速筛查，对比高分辨质谱数据库中包含的离子碎片信息，得到相应鉴定结果；

18、s24、基于步骤s23中的鉴定结果，同步提取样本相应代谢物一级质谱峰面积进行比较，对样本进行相对定量分析。

19、本发明的有益效果在于：采用超高效液相色谱-高分辨质谱的优势，有针对性的建立氨基酸类代谢物高分辨液质联用分析方法并展开应用，通过高分辨质谱数据库中代谢物名称、分子式、母离子及特征离子碎片精确质量信息等，能够对植物样本中该类成分进行快速准确鉴定和注释，同时，根据相应代谢物的一级质谱数据进行相对定量分析，为揭示机体氨基酸代谢网络的变化提供有效技术支撑和高度的可靠性。相较于现有研究而言，本发明构建的分析方法覆盖面更广，涵盖93种氨基酸及其代谢物，针对性更强，鉴定置信度更高，弥补了因质谱信息缺失、仪器类型和状态以及数据采集方法不同所导致的鉴定准确度不足。

技术特征：

1.一种氨基酸类代谢物的高分辨液质联用分析方法，其特征在于，所述分析方法包括如下步骤：

2. 根据权利要求1所述的氨基酸类代谢物的高分辨液质联用分析方法，其特征在于，步骤s12中，所述标准品溶液体系所使用的溶剂包括超纯水、0.1 m hcl和0.16% naoh的任意一种，浓度为5-10 μg/ml。

3. 根据权利要求1所述的氨基酸类代谢物的高分辨液质联用分析方法，其特征在于，步骤s12中氨基酸类代谢物标准品溶液配制原则包括：选择精准分子量不相同的每10种标准品的单标储备液混合配制为混标储备液；若剩余有不足10种的精准分子量不相同的2种或2种以上标准品的单标储备液，也将其全部混合配制为混标储备液；以超纯水为溶剂，分别将各混标储备液稀释为5-10 μg/ml的混标工作液；精准分子量相同的标准品的单标储备液仍然保持单标形式，以超纯水为溶剂，分别将其稀释为5-10 μg/ml的单标工作液。

4. 根据权利要求1所述的氨基酸类代谢物的高分辨液质联用分析方法，其特征在于，步骤s13中所使用的色谱柱为acquity hss t3超高效液相色谱柱，兼顾极性和非极性化合物分离。

5.根据权利要求1所述的氨基酸类代谢物的高分辨液质联用分析方法，其特征在于，步骤s13中所使用仪器为超高效液相色谱-四极杆-静电场轨道阱质谱。

6. 根据权利要求1所述的氨基酸类代谢物的高分辨液质联用分析方法，其特征在于，步骤s13中碰撞能为10-100 ev。

7.根据权利要求1所述的氨基酸类代谢物的高分辨液质联用分析方法，其特征在于，以构建的高分辨质谱数据库中氨基酸类代谢物二级离子碎片信息作为定性依据。

8.一种根据权利要求1-7任一项所述的氨基酸类代谢物高分辨液质联用分析方法的应用，其特征在于，该应用步骤如下：

技术总结
本发明涉及植物代谢分析领域，具体为一种氨基酸类代谢物的高分辨液质联用分析方法及应用。利用超高效液相色谱‑四极杆‑静电场轨道阱质谱联用技术，建立了93种氨基酸类代谢物定性分析方法，获取代谢物高分辨质谱信息并建立质谱数据库。对比高分辨质谱数据库中相应的特征碎片离子，能够对植物体内氨基酸类代谢物进行快速筛查、准确鉴定和相对定量，并在西瓜和猕猴桃等植物样本中进行了分析应用。本发明构建的分析方法覆盖面更广，针对性更强，鉴定置信度更高，弥补了因质谱信息缺失、仪器类型和状态以及数据采集方法不同所导致的鉴定准确度不足。

技术研发人员：李妍,秦国臣
受保护的技术使用者：北京大学现代农业研究院
技术研发日：
技术公布日：2024/1/15