一种虹彩细胞的石蜡切片方法

本发明涉及细胞染色，特别涉及一种虹彩细胞的石蜡切片方法。

背景技术：

1、体色是鱼类重要的性状之一，也是鱼类在适应环境过程中经过长期自然选择的结果。鱼类体色和斑纹等图案是由皮肤中分布的色素细胞的种类、数目、色素细胞中包含的色素颗粒的状态以及虹彩细胞中晶体反射小板的反光能力强弱共同形成的。目前在鱼类中共发现5种类型的色素细胞，集中分布于皮肤组织真皮层，分别有黑色素细胞(melanincell)、红色素细胞(erythrophore)、黄色素细胞(xanthophore)、蓝色素细胞(canophore)和虹彩细胞(iridocyte)。虹彩细胞作为鱼类一种重要的色素细胞，可以通过结构颜色参与多项生理过程如增加显着性(例如增强皮肤反射率、警示色和婚姻色)、伪装、温度调节机制、体色快速变化以及眼睛虹膜的组成等。鱼类的虹彩细胞可以根据细胞大小分为s型和l型两类虹彩细胞。豹纹鳃棘鲈(plectropomus leopardus)又称豹纹鳃棘鲈、花斑刺鳃鲈、七星斑等，是属于鲈形目、鮨科、石斑鱼亚科、鳃棘鲈属、蓝点鳃棘鲈种。分布在印度洋—太平洋的热带或者亚热带水域中，集中于南海、东海和西太平洋的珊瑚礁边缘有着复杂的社会结构和多变体色如黑褐色、棕色和红色。豹纹鳃棘鲈(plectropomus leopardus)作为我国重要的经济鱼种，在长期自然选择中为适应生存环境和实现种群交流，形成了特有的体色：鱼体呈现明亮的红色，除腹侧以外的皮肤组织分布着蓝色斑点。体色是豹纹鳃棘鲈重要的经济性状。该性状主要与皮肤组织中分布的色素细胞的种类、数量和状态有关。目前对于豹纹鳃棘鲈体色形成及调控机制尚不明确，国内对豹纹鳃棘鲈体色的研究主要集中在黑色素细胞和红色素细胞方面，而对于豹纹鳃棘鲈虹彩细胞的研究相对匮乏。对虹彩细胞研究匮乏的原因部分是由于虹彩细胞因其无色性及内部含有特殊鸟嘌呤晶体结构，所以普通石蜡包埋和he染色法往往导致虹彩细胞脱片和整个皮肤组织切片破碎，无法完成豹纹鳃棘鲈皮肤组织中的虹彩细胞的组织学观察和分析。要了解豹纹鳃棘鲈皮肤组织中虹彩细胞功能特点并探究虹彩细胞在豹纹鳃棘鲈体色构成及生理学体色变化的作用，就需要对豹纹鳃棘鲈皮肤进行组织学观察，对虹彩细胞的种类、形态特征、分布特点和不同生理状态下虹彩细胞的变化进行组织学分析。因此探索出适合豹纹鳃棘鲈虹彩细胞的常规切片包埋和染色方法是探索虹彩细胞在豹纹鳃棘鲈体色遗传控制和遗传变异中的作用首先要解决的问题。

技术实现思路

1、鉴于此，本发明的目的在于提出一种虹彩细胞的石蜡切片方法，解决了豹纹鳃棘鲈虹彩细胞固定不充分及组织切片不完整等问题，可获得形态特征清晰完整的虹彩细胞组织切片，为探究虹彩细胞在体色调控中的作用做了良好的铺垫。

2、本发明的技术方案是这样实现的：

3、一种虹彩细胞的石蜡切片方法，在取样固定步骤时，选用包括苯酚和甲醛作为组织固定液，所述组织固定液中苯酚的体积浓度为1～2％，甲醛的质量浓度为6～8％。

4、相应地，固定的温度为3～5℃，固定的时间为24～36h。

5、相应地，取样固定后，还包括琼脂糖预包埋步骤、脱水与浸蜡步骤、石蜡包埋步骤、组织切片步骤、切片染色步骤；

6、预包埋步骤使用琼脂糖溶液的制备方法，包括：先用超纯水配制质量浓度为1.8％～2.2％琼脂糖溶液，采用无水乙醇稀释至质量浓度为0.8％～1.2％，得目标琼脂糖溶液，目标琼脂糖溶液使用的温度为40～45℃。

7、相应地，在脱水与浸蜡步骤时，包括依次采用体积浓度70％～75％乙醇溶液处理1.5～2.5h、体积浓度80％～85％乙醇溶液处理1.5～2.5h、体积浓度90％～95％乙醇溶液处理1.5～2.5h、无水乙醇处理3～5h、无水乙醇与二甲苯混合液处理1.5～2.5h、二甲苯处理30～50min、二甲苯与石蜡混合液处理0.5～1.5h和石蜡处理1.5～2.5h。

8、相应地，在切片染色步骤时，采用二甲苯、二甲苯与无水乙醇混合液、无水乙醇、体积浓度90％～95％乙醇溶液、质量浓度0.4％～0.6％伊红染液、体积浓度80％～85％乙醇溶液、体积浓度90％～95％乙醇溶液进行染色处理。

9、相应地，在切片染色步骤时，依次采用二甲苯处理5～7min、无水乙醇与二甲苯混合液处理2.5～3.5min、无水乙醇处理4～6min、体积浓度90％～95％乙醇溶液处理1.5～2.5min、质量浓度0.4％～0.6％伊红染液处理0.5～1.5min、体积浓度80％～85％乙醇溶液处理1.5～2.5min、体积浓度90％～95％乙醇溶液处理1.5～2.5min、无水乙醇处理5～7min、无水乙醇与二甲苯混合液处理2.5～3.5min、二甲苯处理5～7min。

10、相应地，采用二甲苯与无水乙醇混合液时，无水乙醇和二甲苯的体积比为1～2：1～2；采用二甲苯与石蜡混合液时，二甲苯和石蜡的体积比为1～2：1～2。

11、本发明还提供一种采用上述的虹彩细胞的石蜡切片方法在制备鱼类虹彩细胞组织切片中的应用。

12、相应地，鱼类为豹纹鳃棘鲈。

13、与现有技术相比，本发明的有益效果为：

14、1、本发明解决了传统固定方式获得的虹彩细胞固定不充分问题，获得了清晰形态的虹彩细胞组织切片，对虹彩细胞种类鉴定及组织学分析有重要意义。

15、2、本发明解决了豹纹鳃棘鲈皮肤组织切片破碎不完整的问题，获得了形态完整的皮肤组织切片，对豹纹鳃棘鲈虹彩细胞及其他色素细胞的分布及不同生理状态下虹彩细胞的形态学变化及分布分析有着重要意义，并且使用本发明的方法，可鉴定到豹纹鳃棘鲈被遗漏的虹彩细胞类型。

16、3、本发明可用于其他鱼类虹彩细胞的组织学分析，为鱼类虹彩细胞及皮肤的组织学研究提供了更适合的方法，也为研究虹彩细胞在鱼类体色调控中的作用起到了推动作用。

技术特征：

1.一种虹彩细胞的石蜡切片方法，其特征在于，在取样固定步骤时，选用包括苯酚和甲醛作为组织固定液，所述组织固定液中苯酚的体积浓度为1～2％，甲醛的质量浓度为6～8％。

2.根据权利要求1所述的虹彩细胞的石蜡切片方法，其特征在于，固定的温度为3～5℃，固定的时间为24～36h。

3.根据权利要求1所述的虹彩细胞的石蜡切片方法，其特征在于，取样固定后，还包括琼脂糖预包埋步骤、脱水与浸蜡步骤、石蜡包埋步骤、组织切片步骤、切片染色步骤；

4.根据权利要求3所述的虹彩细胞的石蜡切片方法，其特征在于，在脱水与浸蜡步骤时，包括依次采用体积浓度70％～75％乙醇溶液处理1.5～2.5h、体积浓度80％～85％乙醇溶液处理1.5～2.5h、体积浓度90％～95％乙醇溶液处理1.5～2.5h、无水乙醇处理3～5h、无水乙醇与二甲苯混合液处理1.5～2.5h、二甲苯处理30～50min、二甲苯与石蜡混合液处理0.5～1.5h和石蜡处理1.5～2.5h。

5.根据权利要求3所述的虹彩细胞的石蜡切片方法，其特征在于，在切片染色步骤时，采用二甲苯、二甲苯与无水乙醇混合液、无水乙醇、体积浓度90％～95％乙醇溶液、质量浓度0.4％～0.6％伊红染液、体积浓度80％～85％乙醇溶液、体积浓度90％～95％乙醇溶液进行染色处理。

6.根据权利要求5所述的虹彩细胞的石蜡切片方法，其特征在于，在切片染色步骤时，依次采用二甲苯处理5～7min、无水乙醇与二甲苯混合液处理2.5～3.5min、无水乙醇处理4～6min、体积浓度90％～95％乙醇溶液处理1.5～2.5min、质量浓度0.4％～0.6％伊红染液处理0.5～1.5min、体积浓度80％～85％乙醇溶液处理1.5～2.5min、体积浓度90％～95％乙醇溶液处理1.5～2.5min、无水乙醇处理5～7min、无水乙醇与二甲苯混合液处理2.5～3.5min、二甲苯处理5～7min。

7.根据权利要求4或6所述的虹彩细胞的石蜡切片方法，其特征在于，采用二甲苯与无水乙醇混合液时，无水乙醇和二甲苯的体积比为1～2：1～2；采用二甲苯与石蜡混合液时，二甲苯和石蜡的体积比为1～2：1～2。

8.一种采用权利要求1～7任一项所述的虹彩细胞的石蜡切片方法在制备鱼类虹彩细胞组织切片中的应用。

9.根据权利要求8所述的应用，其特征在于，鱼类为豹纹鳃棘鲈。

技术总结
本发明提出了一种虹彩细胞的石蜡切片方法，在取样固定步骤时，选用包括苯酚和甲醛作为组织固定液，所述组织固定液中苯酚的体积浓度为1～2％，甲醛的质量浓度为6～8％。本发明解决了传统固定方式获得的虹彩细胞固定不充分问题，获得了清晰形态的虹彩细胞组织切片，对虹彩细胞种类鉴定及组织学分析有重要意义。

技术研发人员：胡景杰,汪波,马嘉忆,王梦娅,韦存,吴绍轩,丁晖,李培宇,包振民
受保护的技术使用者：中国海洋大学三亚海洋研究院
技术研发日：
技术公布日：2024/1/15