稀土螯合剂荧光标记物在制备用于检测冠状病毒抗原检测试剂盒中的应用

本发明属免疫分析检测，具体涉及稀土螯合剂荧光标记物在制备用于检测冠状病毒抗原检测试剂盒中的应用。

背景技术：

1、用于做核酸检测的实验室应是p3实验室，需要做严格的防护，不仅操作流程严格，还需要高级别的检测设备和熟练技术操作人员。另外，核酸检测耗时长、易污染、成本极高。

2、此前被广泛采用的核酸检测试剂无法在病毒感染早期时提供快速准确的检测结果，新冠抗原检测兼具方便、快速和低价这三项优势，因此抗原检测被各个国家重视，逐渐成为一种重要的检测方法如表1。

3、目前主要采用胶体金和荧光标记两种技术。稀土荧光纳米粒子虽然灵敏度高，但cv高。国内至今尚未能获证。提高检测速度和精准度仍然是现存的主要问题：

4、表1国内外抗原检测产品比较

5、

6、

7、因此，提高检测灵敏度和精准度仍然是现存的主要问题：

8、1、胶体金作为指示剂只能定性检测，易出现漏检(假阴性)。

9、2、荧光染料检测灵敏度高，但背景干扰导致准确度差。

10、3、稀土荧光微球检测灵敏度高，但微球尺寸的不均匀性和宽谱带的干扰导致变异系数(c v)升高，使得准确度差。

11、因此，亟需开发一种快速的、低成本、检出限低、准确度高、使用方便的sars-co v-2新型冠状病毒抗原检测技术。

12、与rna一样，结构蛋白是新冠状病毒的特异性标志物，同时也是刺激患者产生特异性抗体的病毒抗原。如表1所示，病毒抗原检测具有快速、简单、便捷、经济、不需要设备，对操作人员、环境等要求不高等优点，还具备早期诊断、可信度高等优势。

13、据文献报道，一个冠状病毒粒子仅含有1条rna，而其s1蛋白与n蛋白的平均含量则为含有222分子和3000多分子。以此计算，当s1抗原检测的灵敏度(最低检出限)达到6-30pg/ml或者n抗原检测的灵敏度(最低检出限)达到40-200pg/ml时，其对成熟冠状病毒的检测灵敏度即可等于核酸检测(200-1000拷贝/ml，即3-15pg/ml)。除此之外，由于病毒复制早期会释放大量不含核酸的游离抗原，感染极早期与活动期的核酸阴性样本，也可能显示为抗原阳性。例如，在sars-cov感染早期(第1-10天)，多达70％患者血液中含有高水平的n蛋白，而血液中的核酸含量几乎不能到达检出水平。因此，抗原理论上是比核酸更理想的检测靶标。由于一个病毒粒子是由一条核酸分子和数千个抗原所组成,病毒核酸阳性的样本中理论上含有大量的病毒抗原,因此也可以作为抗原检测的样本。此外,由于病毒复制过程中往往会产生大量的游离抗原,一些病毒核酸阴性的样本(如血清)中也可能检测到高水平的病毒抗原。因此,只要检出限足够低,抗原检测的可靠性和检出率完全可以达到与核酸检测相同的水平,甚至可以更好。2019-ncov核酸检测和抗原检测方法比较。如表2.

14、表2 2019-ncov核酸检测和抗原检测方法比较

15、

技术实现思路

1、本发明的目的是提供一种稀土螯合剂荧光标记物在制备用于检测冠状病毒抗原检测试剂盒中的应用，本发明采用稀土小分子螯合剂标记新冠病毒s蛋白或者n蛋白抗体，所制备标记物直接用于新冠病毒抗原的检测，采用时间分辨检测，消除背景信号干扰，极大提高了新冠病毒抗原检测的灵敏度和精准度。

2、本发明提供一种稀土螯合剂荧光标记物在制备用于检测冠状病毒抗原检测试剂盒中的应用，所述的稀土螯合剂荧光标记物包括：稀土螯合剂、抗体和稀土离子；

3、所述的稀土螯合剂选自螯合剂a或螯合剂b中的一种，结构如下：

4、

5、优选的是，所述的抗体为bsa、n蛋白抗体、igg、乙肝表面抗体、c反应蛋白抗体。

6、优选的是，所述的稀土离子为铕。

7、优选的是，所述的稀土螯合剂荧光标记物的制备方法，包括：

8、将稀土螯合剂溶于溶剂中后用缓冲液稀释，然后加入到抗体的缓冲溶液中，孵育，再加入含有稀土离子的溶液中反应，经透析或层析分离得到稀土螯合剂荧光标记物。

9、优选的是，所述的溶剂为dmf或dmso。

10、优选的是，所述的缓冲液为ph7.5-9.5pbs或碳酸盐(cbs)缓冲溶液。

11、优选的是，所述的孵育是在室温孵育6h-12h,或37℃孵育0.5-2h。

12、优选的是，所述的反应温度为室温，反应时间为0.5-2h。

13、优选的是，所述的抗体和稀土螯合剂的摩尔比为1：20-1：90。

14、优选的是，所述的抗体和稀土离子的摩尔比为1：2-10。

15、本发明的有益效果

16、1、本发明使用异硫氰基、氯磺基活性基团的稀土螯合剂标记抗体，可以在温和的条件下与抗体上的氨基缩合成为稳定的酰胺键，得到长荧光寿命，高荧光强度，高免疫活性的稀土螯合剂荧光标记物。

17、2、本发明采用小分子螯合剂为示踪物，代替同位素、荧光素、化学发光、微球等物质，标记蛋白质、多肽、激素、抗体、核酸探针或生物活性物质，具有制备方法简便、低背景检测和应用范围广泛等优点。

18、3、相比于核酸pcr检测试剂，能够有效突破现有检测技术对人员、场所的限制，生产环境要求低、感染风险低；操作检测便捷，对操作人员技术要求低；检测迅速(15min)；检测成本低。

19、4、相比稀土微球层析检测，标记物制备简单，cv低，准确度高。

20、5、与传统荧光层析法检测相比，采用时间分辨检测，消除了高背景干扰，精准度高。

21、6、针对sars-cov-2新型冠状病毒，开发新型抗原精准、快速诊断试剂盒，实现对新型冠状病毒感染患者的鼻咽拭子、口咽拭子、或痰液中的新冠病毒核壳蛋白(nucleocapsidprotein，或称n蛋白)的快速精准检测。

技术特征：

1.稀土螯合剂荧光标记物在制备用于检测冠状病毒抗原检测试剂盒中的应用，其特征在于，所述的稀土螯合剂荧光标记物包括：稀土螯合剂、抗体和稀土离子；

2.根据权利要求1所述的稀土螯合剂荧光标记物在制备用于检测冠状病毒抗原检测试剂盒中的应用，其特征在于，所述的抗体为bsa、n蛋白抗体、igg、乙肝表面抗体、c反应蛋白抗体。

3.根据权利要求1所述的稀土螯合剂荧光标记物在制备用于检测冠状病毒抗原检测试剂盒中的应用，其特征在于，所述的稀土离子为铕。

4.根据权利要求1所述的稀土螯合剂荧光标记物在制备用于检测冠状病毒抗原检测试剂盒中的应用，其特征在于，所述的稀土螯合剂荧光标记物的制备方法，包括：

5.根据权利要求4所述的稀土螯合剂荧光标记物在制备用于检测冠状病毒抗原检测试剂盒中的应用，其特征在于，所述的溶剂为dmf或dmso。

6.根据权利要求4所述的稀土螯合剂荧光标记物在制备用于检测冠状病毒抗原检测试剂盒中的应用，其特征在于，所述的缓冲液为ph 7.5-9.3pbs或碳酸盐缓冲溶液。

7.根据权利要求4所述的稀土螯合剂荧光标记物在制备用于检测冠状病毒抗原检测试剂盒中的应用，其特征在于，所述的孵育是在室温孵育6h-12h,或37℃孵育0.5-2h。

8.根据权利要求4所述的稀土螯合剂荧光标记物在制备用于检测冠状病毒抗原检测试剂盒中的应用，其特征在于，所述的反应温度为室温，反应时间为0.5-2h。

9.根据权利要求4所述的稀土螯合剂荧光标记物在制备用于检测冠状病毒抗原检测试剂盒中的应用，其特征在于，所述的抗体和稀土螯合剂的摩尔比为1：20-1：90。

10.根据权利要求4所述的稀土螯合剂荧光标记物在制备用于检测冠状病毒抗原检测试剂盒中的应用，其特征在于，所述的抗体和稀土离子的摩尔比为1：2-10。

技术总结
本发明提供一种稀土螯合剂荧光标记物在制备用于检测冠状病毒抗原检测试剂盒中的应用，属于荧光免疫分析技术领域。所述的稀土螯合剂荧光标记物包括：稀土螯合剂、抗体和稀土离子；所述的稀土螯合剂选自螯合剂A或螯合剂B中的一种。本发明建立SARS‑CoV‑2N蛋白抗原检测法，线性范围为0.04ng～800ng/mL，相关系数为0.9897，变异系数CV＜8％。与目前诊断所用的RT‑PCR核酸检测相比，能够有效突破现有检测技术对人员、场所的限制，缩短检测用时，简单高效、成本低廉。

技术研发人员：潘利华,刘作家,常宇,刘俊,周亮,马鑫,张璇
受保护的技术使用者：中国科学院长春应用化学研究所
技术研发日：
技术公布日：2024/1/16