一种基于玻璃基的单细胞呼吸率测定传感器及应用

本发明属于传感器，尤其涉及一种基于玻璃基的单细胞呼吸率测定传感器及应用。

背景技术：

1、细胞发育依赖于各种代谢活动，特别是呼吸作用，它是维持细胞活力，进行氧气交换所需的最基本的活动之一。细胞呼吸速率检测的相关技术可以帮助医生和研究人员更好地了解胚胎细胞的生长和发育过程，提高胚胎的存活率和发育质量。呼吸率的测定是基于电化学方法。

2、电化学方法的原理：

3、电化学反应是一种特殊的氧化还原反应，是有关电与化学变化关系的一个化学分支。电化学反应过程中常伴随着电极表面析氢、析氧的电极反应，同时电极界面上将发生电子的转移,继而产生还原电流。该电流的大小与发生氧化还原反应物质浓度成正比，因此可以以此来间接测定物质的浓度大小。电化学反应涉及以下几个重要部分：工作电极(we)、参比电极(re)、对电极(ce)以及恒电位仪。

4、(1)恒电位仪是一种用于保持恒定电位并测量皮安范围内的电流以检测非常小的变化的装置，主要用来控制工作电极和参比电极之间电压差，以及测量工作电极和对电极之间的电流。

5、(2)工作电极是我们想要控制或研究的反应发生的地方，最常见的工作电极是铂圆盘电极。

6、(3)参比电极拥有稳定的电势，在循环伏安法中，借由控制参比电极上零电流通过，由工作电极和参比电极间电势差测得工作电极电势大小。

7、(4)对电极作用是和工作电极组成一个串联回路，只起到导电的作用，对电极通常拥有比工作电极大得多的表面积。

8、现有技术一的技术方案

9、扫描电化学显微镜技术(secm)

10、扫描电化学显微镜(secm)是范围更广的扫描探针显微镜(spm)中的一项技术，用于测量液体/固体、液体/气体和液体/液体界面的局部电化学行为。扫描电化学显微镜技术的工作过程是基于电化学原理,将超微电极作为工作探针浸入电解质溶液中，利用驱动非常小的电极(探针)在靠近样品处进行扫描，通过分析探针上的电流变化来获取样品的二维或三维o2浓度分布。

11、现有技术一的缺点

12、尽管secm可以评估细胞呼吸活动，但如果不经过培训，就很难精确地操作脆弱的探针。而且，secm每次测量只能确定一个样品，扫描时间长、吞吐量很低。

技术实现思路

1、本发明的目的在于解决上述现有技术存在的缺陷，提供一种基于玻璃基的单细胞呼吸率测定传感器及应用，传感器具有独特的结构设计并与电化学技术相结合，采用微阵列同心环电极的布局，摆脱传统扫描电化学显微镜(secm)方法的固有弊端与复杂操作，可实现对细胞周边氧气浓度快速且精确的测量。

2、本发明提出了一种基于玻璃基的片上设备，可以准确、轻松、无创地测量单个胚胎细胞的o2消耗率。

3、本发明通过微加工技术实现了在玻璃基芯片上制造用于胚胎沉降的铂金(pt)电极阵列和微坑。

4、本装置通过用移液管将胚胎放入坑中来检测胚胎周围的o2浓度分布，与探针电极相比，本发明操作更加容易。

5、本发明利用施加电压时，ce接高电平，we接低电平，通过测量ce电极上发生的还原电流来测量氧气浓度，继而对细胞呼吸速率进行测量。

6、本发明采用如下技术方案：

7、圆盘电极结构，包括玻璃基底、在玻璃基底上具有的si o2沉积层，s i o2沉积层上等间隔布置有6个铂金圆盘电极，在玻璃基底中央具有微坑，微坑内盛放胚胎单细胞。

8、工作原理为：

9、在检测前会用矿物油覆盖在每个圆孔表面，这样可以防止氧气的流失，确保一定的氧气初始浓度。然后中央微坑中的胚胎细胞在进行呼吸作用时，会消耗氧气，因此越是靠近细胞的区域，其氧气浓度越低，越是远离的区域，氧气浓度越高(换个角度，氧气的浓度侧面就反应细胞呼吸速率的大小，所以可以使用氧气浓度来表征呼吸速率)。但是氧气的浓度本身是不方便测量的，因为区域中不单单含有氧气这一个气体，还会有其他类型的物质，因此就需要利用其他方式间接的对氧气浓度进行检测。于是就利用到了电化学方法，利用工作电极上的氧化还原反应，产生的电流大小来反映氧气浓度的大小(因为“电流大小与发生氧化还原反应物质浓度成正比”)。

10、当芯片通电后，铂金圆盘电极作为电化学反应的工作电极(we)，在上面会发生氧化还原反应，继而会消耗部分氧气产生部分还原电流。参与反应是氧气浓度越高，还原电流越大，通过测量还原电流实现氧浓度测量，继而确定呼吸速率。

11、本发明的有益效果：

12、本发明的o2浓度分析可以评估单个胚胎、细胞聚集体和单个细胞的呼吸速率，而不会对样品造成任何损坏。同时实验测量可以在不使用任何标记的情况下，在与细胞培养非常相似的条件下进行检测。此外，为了解决电极通电对o2消耗造成测量的影响，采用了归一化的方法进行误差的去除，保证测量结果的准确。

13、本发明通过使用微加工技术，在玻璃基衬底上制造了微坑和pt微电极。微坑用于捕获胚胎，而电极环绕微坑周围以检测其周围的o2浓度。这些电极被布置在距凹坑中心120μm、170μm、220μm、300μm、400μm和500μm处，以便o2可以估计浓度分布。只需要将目标单细胞放入坑中，所有测量在通电后都会自动进行。同时使用了一种归一化方法来校正消除电极参与氧气消耗对胚胎氧消耗的测量造成的影响，并计算从样品中得出的精确o2浓度分布。通过使用传感器设备和测量方法，成功测量了小鼠胚胎的o2消耗率。使用传感器获得的结果与使用传统方法secm获得的结果相似，该传感器将在促进胚胎和细胞代谢研究方面发挥重要作用，显示出作为细胞分析新工具的巨大应用潜力。

14、胚胎的呼吸活动被认为反映了胚胎的发育潜能，是不孕症治疗提高妊娠率所需的信息之一。这些信息可能有助于提高人类的生育能力。虽然secm是细胞分析的可靠工具，但由于操作复杂，很难应用于临床。本发明提出的检测胚胎o2消耗率的电化学传感器以及检测方法，因其自身的易于操作和准确结果，可以实现无创的单细胞氧气浓度分布监测和呼吸速率的测量，作为secm的替代品。

技术特征：

1.一种基于玻璃基的单细胞呼吸率测定传感器，其特征在于，传感器从上到下一共分为4层，分别是最上层的顶层外壳，第二层的三电极工作区，第三层的印刷电路板以及最下层的底板。

2.根据权利要求1所述的基于玻璃基的单细胞呼吸率测定传感器，其特征在于，第二层的三电极分别是参比电极、对电极、工作电极。

3.根据权利要求2所述的基于玻璃基的单细胞呼吸率测定传感器，其特征在于，传感器顶层外壳中设计了6个圆孔，最左侧圆孔是参比电极和对电极的公共端，作为初始底噪状态的参考；右侧其余5个圆孔用于盛放待测单细胞，下方对应5个工作电极。

4.根据权利要求2所述的基于玻璃基的单细胞呼吸率测定传感器，其特征在于,工作电极由微坑和铂电极组成，微坑是一个由48个pt电极同心包围的中央微坑。

5.工作电极的制造方法，其特征在于，

6.根据权利要求5所述的工作电极的制造方法，其特征在于，其中微坑直径200μm，深度80μm。

7.根据权利要求5所述的工作电极的制造方法，其特征在于，pt圆盘与中央微坑之间的距离分别为120μm、170μm、220μm、300μm、400μm和500μm，其中各距离上均有八个pt圆盘。

8.对电极和参比电极的制造方法，其特征在于，最左侧作为公共端的圆孔腔中，通过ti/pt溅射制造的pt电极用作参比电极和对电极芯片，pt电极的顶部半圆形用作参比电极，下半部分用作对电极。

9.一种基于玻璃基的单细胞呼吸率测定传感器的检测方法，其特征在于，

10.根据权利要求9所述基于玻璃基的单细胞呼吸率测定传感器的检测方法，其特征在于，测量时，使用数据归一化，消除o2还原电流的初始变化，具体包括：

技术总结
本发明提供一种基于玻璃基的单细胞呼吸率测定传感器及应用，其中传感器从上到下一共分为4层，分别是最上层的顶层外壳，第二层的三电极工作区，第三层的印刷电路板以及最下层的底板。本发明传感器具有独特的结构设计并与电化学技术相结合，采用微阵列同心环电极的布局，摆脱传统扫描电化学显微镜(SECM)方法的固有弊端与复杂操作，可实现对细胞周边氧气浓度快速且精确的测量。

技术研发人员：郭劲宏,金佳淇
受保护的技术使用者：重庆医科大学绍兴柯桥医学检验技术研究中心
技术研发日：
技术公布日：2024/1/16