一种水中大肠杆菌高倍浓缩和灵敏检测的系统及其应用

本发明涉及水环境检测领域，更具体地涉及一种水中大肠杆菌高倍浓缩和灵敏检测的系统及其应用。

背景技术：

1、由于水资源问题日益严峻，由水媒病原体引起的肠道寄生虫感染和腹泻病已成为环境致病和死亡的主要原因。干净的水源是人们日常活动的必需品。鉴于许多水传播病原体的传染剂量很低，环境中即使只有一种细菌的存在也可能构成严重的健康风险。根据美国环境保护署(epa)的规定，环境娱乐样品中的大肠杆菌(e.coli)和肠球菌(enterococci)的浓度应分别小于1.26和0.35cfu/ml。这些严格的标准要求检测方法不仅要超灵敏，而且要定量和精确。

2、现有的细菌富集方法操作繁琐，富集率较低，且价格高昂，而对于细菌的检测往往采用培养的方法，它们需要几天才能获得结果，而且很难在物种水平上区分细菌。定量实时聚合酶链反应(pcr)可以将时间缩短到几个小时，但它需要昂贵的仪器，并且不适合绝对定量。基于微流体的单细胞检测被认为是有前途的分析方法，在这种情况下，每个细胞被封装成一个单独的液滴，可实现对细菌的单个检测。基于97％大肠杆菌存在β-葡萄糖苷酸酶，它可以催化荧光底物6-氯-4-甲基伞形酮-β-d-葡糖苷酸产生荧光物质6-氯-4-甲基伞形酮，在特定激发光波长下被观察到，从而实现直接计数。针对其他细菌也可以使用相对性的荧光底物，实现简单、快速的计数目的。基于上述依据，可以探索一种自动化、耗时短、效率高的水中细菌富集及检测装置，对于水环境的检测具有重大应用意义。

技术实现思路

1、本发明的目的是提供一种水中大肠杆菌高倍浓缩和灵敏检测的系统及其应用，从而解决现有技术中细菌富集方法操作繁琐，富集率较低，价格高昂、检测时间长的问题。

2、根据本发明的第一方面，提供一种水中大肠杆菌高倍浓缩和灵敏检测的系统，包括：第一富集装置，其包括：样品瓶、第一处理液瓶、第一废液瓶、第一富集液瓶、第一富集芯片、以及泵，所述第一富集芯片包括：上层支架、下层支架、以及夹设于上层支架与下层支架之间的第一滤膜、第二滤膜，通过对电磁阀的控制，使样品液被泵入第一富集芯片中，杂质被第一滤膜过滤，大肠杆菌被截留在第二滤膜上，经过处理液反冲得到大肠杆菌被第一次富集的第一富集液；第二富集装置，其包括：第二处理液瓶、第二富集液瓶、第二废液瓶、电磁阀、第二富集芯片、以及泵，所述第二富集芯片包括：第一层芯片、第二层芯片、第三层芯片、以及夹设于第一层芯片与第二层芯片之间的第三滤膜、夹设于第二层芯片与第三层芯片之间的第四滤膜，通过对电磁阀的控制，使第一富集液被泵入第二富集芯片中，杂质被第三滤膜过滤，大肠杆菌被截留在第四滤膜上，经过处理液反冲得到大肠杆菌被第二次富集的第二富集液；以及液滴微流控装置，其包括：液滴微流控芯片、加热板、油相瓶、电磁阀以及泵，通过对电磁阀的控制，使第二富集液在油相的剪切力作用下生成油包水微液滴，大肠杆菌在微液滴内发生酶促反应产生荧光，通过光学显微镜拍照，即可实现对水源中大肠杆菌浓度的检测。

3、优选地，第一富集芯片中，上层支架上设有样本进口、第一富集液出口、以及连接二者的上层双螺旋流道，下层支架上设有废液进口、处理液进口、以及连接二者的下层双螺旋流道，所述上层、下层双螺旋流道之间通过第一滤膜、第二滤膜隔开，以分别实现杂质的过滤以及大肠杆菌的截留。

4、优选地，上层支架、下层支架采用环氧树脂材料制成。

5、优选地，第二富集芯片中，第一层芯片上设有第一富集液进口、废液出口、第二处理液进口、第二富集液出口，以及中心孔，其中，废液出口、第二处理液进口、第二富集液出口、中心孔自上而下依次贯穿该第一层、第二层、第三层芯片，第三滤膜和第四滤膜分别设置于相应的中心孔处。

6、优选地，第一层芯片上的第一富集液进口、废液出口、第二处理液进口、第二富集液出口均通过电磁阀控制。

7、优选地，第一滤膜、第三滤膜的孔径为8～30μm，第二滤膜、第四滤膜的孔径为0.2～1μm。

8、优选地，第一富集装置可实现水样从100ml到5ml的富集，第二富集装置可实现水样从5ml到100μl的富集。

9、优选地，所述液滴微流控芯片上设有富集液进口、油相进口、富集液流道、油相流道、液滴观察区以及废液出口，富集液流道与油相流道在一个十字形结构处交汇以利于微液滴的形成，所述液滴观察区内部还设有支撑柱。

10、根据本发明的第二方面，提供一种所述水中大肠杆菌高倍浓缩和灵敏检测的系统在水质检测中的应用。

11、本发明的关键发明点主要在于，首次将100ml-5ml富集、5ml-100μl富集、大肠杆菌包裹和检测三种功能集成一体化，基于大肠杆菌和其余杂质的大小设计了带有两种孔径的两层过滤膜的第一富集装置和第二富集装置，分别利用磁控系统及微流控芯片实现膜上大肠杆菌的高效截留以及反冲富集。继而将富集后的菌液通过液滴微流控系统分散成油包水的微小液滴；微液滴生成后平铺在芯片内部，经过42℃，30分钟的孵育，含有目标大肠杆菌的液滴内会反应生成大量荧光物质，在荧光激发下发出荧光，对其进行拍照统计计算，即可得出大肠杆菌浓度，因此本发明能实现现场快速高灵敏检测水中大肠杆菌的功能。根据本发明提供的一种集100ml-5ml浓缩、5ml-100μl浓缩、大肠杆菌包裹和检测于一体的系统，能够富集水中大肠杆菌，去除其他杂质的影响，并实现大肠杆菌的液滴内单包裹和荧光信号的检测。

12、与现有的水体中大肠杆菌富集装置相比，根据本发明提供的水中大肠杆菌高倍浓缩和灵敏检测的系统有以下几个优势：

13、1)两次富集的双层膜富集效率高，不易堵塞，稳定性好；

14、2)通过两次富集使水样从100ml浓缩到100μl，浓缩倍数达到1000倍；

15、3)100μl富集液可以生成数万个大小均一的液滴，每个液滴包裹一个大肠杆菌，实现菌体的单个检测，大大提高了检测的灵敏度；

16、4)自动化程度高，成像检测前的所有操作可通过控制面板进行控制；

17、5)在不更换整体装置的前提下，通过改变荧光底物，可实现各种大肠杆菌的检测；

18、6)所有单元均可长期重复使用，系统更换和维护成本低。

技术特征：

1.一种水中大肠杆菌高倍浓缩和灵敏检测的系统，其特征在于，包括：

2.根据权利要求1所述的系统，其特征在于，第一富集芯片中，上层支架上设有样本进口、第一富集液出口、以及连接二者的上层双螺旋流道，下层支架上设有废液进口、处理液进口、以及连接二者的下层双螺旋流道，所述上层、下层双螺旋流道之间通过第一滤膜、第二滤膜隔开，以分别实现杂质的过滤以及大肠杆菌的截留。

3.根据权利要求1所述的系统，其特征在于，上层支架、下层支架采用环氧树脂材料制成。

4.根据权利要求1所述的系统，其特征在于，第二富集芯片中，第一层芯片上设有第一富集液进口、废液出口、第二处理液进口、第二富集液出口，以及中心孔，其中，第一富集液进口在下方封闭，废液出口、第二处理液进口、第二富集液出口、中心孔自上而下依次贯穿该第一层、第二层、第三层芯片，第三滤膜和第四滤膜分别设置于相应的中心孔处。

5.根据权利要求4所述的系统，其特征在于，第一层芯片上的第一富集液进口、废液出口、第二处理液进口、第二富集液出口均通过电磁阀控制。

6.根据权利要求1所述的系统，其特征在于，第一滤膜、第三滤膜的孔径为8～30μm，第二滤膜、第四滤膜的孔径为0.2～1μm。

7.根据权利要求1所述的系统，其特征在于，第一富集装置可实现水样从100ml到5ml的富集，第二富集装置可实现水样从5ml到100μl的富集。

8.根据权利要求1所述的系统，其特征在于，所述液滴微流控芯片上设有富集液进口、油相进口、富集液流道、油相流道、液滴观察区以及废液出口，富集液流道与油相流道在一个十字形结构处交汇以利于微液滴的形成，所述液滴观察区内部还设有支撑柱。

9.一种如权利要求1-8中任意一项所述的水中大肠杆菌高倍浓缩和灵敏检测的系统在水质检测中的应用。

技术总结
本发明提供一种水中大肠杆菌高倍浓缩和灵敏检测的系统及其应用，该系统包括：第一富集装置，其包括：样品瓶、第一处理液瓶、第一废液瓶、第一富集液瓶、第一富集芯片、以及泵；第二富集装置，其包括：第二处理液瓶、第二富集液瓶、第二废液瓶、电磁阀、第二富集芯片、以及泵；以及液滴微流控装置，其包括：液滴微流控芯片、加热板、油相瓶、电磁阀以及泵，通过对电磁阀的控制，使第二富集液生成油包水微液滴，大肠杆菌在微液滴内发生酶促反应产生荧光，实现对水源中大肠杆菌浓度的检测。本发明通过两次富集使水样中大肠杆菌高倍浓缩，同时通过液滴微流控装置使富集液形成数万个大小均一的液滴，实现菌体的单个检测，提高了检测灵敏度。

技术研发人员：冯世伦,何冰欢,高则航,赵建龙
受保护的技术使用者：中国科学院上海微系统与信息技术研究所
技术研发日：
技术公布日：2024/1/16