不同基原黄精的特征降解糖谱鉴定方法

本发明涉及黄精基原鉴定的，具体是一种不同基原黄精的特征降解糖谱鉴定方法。

背景技术：

1、黄精作为一种传统的药食两用中药，具有广阔的开发与应用前景，其入药部位主要为干燥根茎，能够治疗风湿病，并有利于增强机体免疫功能。根据《中国药典》2020版一部记载，黄精共有三种基原，分别为滇黄精、鸡头黄精及多花黄精，因其所含成分和比例不尽相同，功效存在一定差异，其有效鉴定对于保证黄精临床应用的安全性和有效性非常重要。

2、现阶段，有报道采用传统的显微鉴定、理化鉴别等方法对其进行基原鉴定，抑或是根据其小分子化合物的指纹图谱鉴定其基原。显微鉴定存在一定的主观性，基原鉴定敏感度不高；理化鉴别和小分子化合物指纹图谱的方法专属性较差，且均未从其有效成分多糖的角度进行分析。

技术实现思路

1、为解决上述问题，即解决上述背景技术提出的问题，本发明提出了一种不同基原黄精的特征降解糖谱鉴定方法，具体技术方案如下：

2、不同基原黄精的特征降解糖谱鉴定方法，所述方法包括如下步骤：

3、(1)对黄精多糖进行提取和纯化，将提取纯化后的多糖粉末进行单因素试验考察，取多糖粉末10mg，加0.4ml一定浓度的hcl溶液对多糖粉末在不同条件下进行降解，得到黄精多糖部分降解液，降解过程分别考察不同降解温度、不同降解时间、不同浓度盐酸溶液对黄精多糖部分降解的影响，考察方法如下：黄精多糖部分降解液冷却后，使用naoh溶液调节ph至中性，加水定容至1ml，摇匀，采用pmp衍生，衍生溶液采用hplc测定，将寡糖峰数目和寡糖峰面积按公式进行处理得到综合评分，公式为：

4、m＝0.5x×100÷最大峰数目+0.5y×100÷最大峰面积以此为评价指标得到的最优降解条件为温度80℃，盐酸浓度0.5mol/l，降解时间4h；

5、(2)根据上述单因素考察结果，采用三因素三水平正交设计进行进一步的黄精多糖部分酸降解优化(指标同上)，得到的最优条件为温度80℃，盐酸浓度0.5mol/l，降解时间5h，正交试验的方差分析表明降解温度对其部分降解影响最大，其次为盐酸浓度，最后是降解时间，由于盐酸浓度及降解时间影响不显著，因此最终选择的降解条件为温度80℃，盐酸浓度0.3mol/l，降解时间3h；

6、(3)采用上述优化的多糖部分酸降解条件对各黄精提取多糖进行降解，hplc测定，得到10批样品的多糖部分降解谱(特征降解糖谱)，从利用该谱图进行基原鉴定和质量评价的角度考虑，以寡糖峰数目多及峰面积大者为佳；

7、(4)选取黄精多糖部分降解谱中的寡糖峰和单糖峰，以其峰面积为参数，运用数据统计软件对各谱图进行主成分分析，样品前三个主成分的累计方差贡献率达到85％，基本包含了全部变量所具有的信息，选前三个成分作为主成分，并运用其对黄精多糖的质量进行整体评价。通过聚类分析可知，不同基原的黄精，即多花黄精、鸡头黄精、滇黄精可以很好地聚到一起，从而实现了不同基原黄精的鉴定。

8、进一步地，步骤(1)中，对黄精多糖的提纯方法如下：将黄精粉碎，过60目筛，称取10g黄精粉末于圆底烧瓶中，加入200-300ml水，在80℃条件下回流提取2h，重复三次，合并提取液，对提取液过滤、离心，取上层清液浓缩至30ml，浓缩液加入无水乙醇使其醇浓度达80％，在4℃下静置过夜，4000rpm离心5min，弃上层清液，将沉淀水复溶后转移至分液漏斗中，加入相当于其体积1/5的sevag试剂，剧烈振摇，4000rpm离心5min，取下层水相重复上述操作直至无白色絮状物产生为止，测量除蛋白后溶液的体积，加入四倍体积无水乙醇醇沉过夜，4000rpm离心5min，取下层沉淀，为黄精多糖，冻干备用。

9、进一步地，步骤(1)中，单因素试验考察时，控制变量方法如下：

10、①固定盐酸溶液浓度0.3mol/l、降解时间4h，考察不同降解温度(60、70、80、90、100℃)对黄精多糖部分降解的影响；

11、②固定盐酸溶液浓度0.3mol/l、降解温度80℃，考察不同降解时间(1、2、3、4、5h)对黄精多糖部分降解的影响；

12、③固定降解温度80℃、降解时间4h，考察不同浓度盐酸溶液(0.1、0.3、0.5、0.7、0.9mol/l)对黄精多糖部分降解的影响。

13、进一步地，步骤(1)中，采用pmp衍生方法如下：取多糖降解液200μl，依次加入0.3mol/lnaoh溶液100μl及0.5mol/lpmp甲醇溶液100μl，涡旋混匀后70℃水浴30min。冷却后加入0.3mol/l hcl溶液100μl中和，再加入1ml三氯甲烷，涡旋混匀1min后12000rpm离心3min。

14、进一步地，步骤(1)中，hplc条件如下：c18色谱柱(200mm×4.6mm，5μm)；流动相：乙腈(a)-0.025mol/l磷酸盐缓冲溶液(b)(ph7.5)梯度洗脱；流速：0.8ml/min；检测波长：245nm；进样量：20μl。

15、进一步地，步骤(3)中，多糖部分降解谱中，标号1-8为聚合度依次降低的寡糖峰，9-14为单糖峰，9号峰为葡萄糖。

16、本发明的有益技术效果为：本方法利用中药多糖部分降解产物指纹图谱分析手段对黄精不同基原进行鉴定，进一步完善其定性分析；主要基于多糖的部分降解产物具有原多糖的结构特征以及药理活性，通过建立其特征降解糖谱(指纹图谱)对黄精进行基原鉴定，并可对该中药的质量状况进行初步评价；本方法首先对(多花)黄精多糖进行部分酸降解条件优化，以所得到寡糖峰的数量和峰面积为综合指标得到其部分降解优化条件，进而采用hplc测定不同基原样品的特征降解糖谱，结合聚类分析和主成分分析等实现不同基原黄精的鉴定。

技术特征：

1.不同基原黄精的特征降解糖谱鉴定方法，其特征在于：所述方法包括如下步骤：

2.根据权利要求1所述的不同基原黄精的特征降解糖谱鉴定方法，其特征在于：步骤(1)中，对黄精多糖的提纯和纯化方法如下：将黄精粉碎，过60目筛，称取10g黄精粉末于圆底烧瓶中，加入200-300ml水，在80℃条件下回流提取2h，重复三次，合并提取液，对提取液过滤、离心，取上层清液浓缩至30ml，浓缩液加入无水乙醇使其醇浓度达80％，在4℃下静置过夜，4000rpm离心5min，弃上层清液，将沉淀水复溶后转移至分液漏斗中，加入相当于其体积1/5的sevag试剂，剧烈振摇，4000rpm离心5min，取下层水相重复上述操作直至无白色絮状物产生为止，测量除蛋白后溶液的体积，加入四倍体积无水乙醇醇沉过夜，4000rpm离心5min，取下层沉淀，为黄精多糖，冻干备用。

3.根据权利要求1所述的不同基原黄精的特征降解糖谱鉴定方法，其特征在于：步骤(1)中，单因素试验考察时，控制变量方法如下：

4.根据权利要求1所述的不同基原黄精的特征降解糖谱鉴定方法，其特征在于：步骤(1)中，采用pmp衍生方法如下：取多糖降解液200μl，依次加入0.3mol/lnaoh溶液100μl及0.5mol/lpmp甲醇溶液100μl，涡旋混匀后70℃水浴30min。冷却后加入0.3mol/l hcl溶液100μl中和，再加入1ml三氯甲烷，涡旋混匀1min后12000rpm离心3min。

5.根据权利要求1所述的不同基原黄精的特征降解糖谱鉴定方法，其特征在于：步骤(1)中，hplc条件如下：c18色谱柱(200mm×4.6mm，5μm)；流动相：乙腈(a)-0.025mol/l磷酸盐缓冲溶液(b)(ph7.5)梯度洗脱；流速：0.8ml/min；检测波长：245nm；进样量：20μl。

6.根据权利要求1所述的不同基原黄精的特征降解糖谱鉴定方法，其特征在于：步骤(3)中，多糖部分降解谱中，标号1-8为聚合度依次降低的寡糖峰，9-14为单糖峰，9号峰为葡萄糖。

技术总结
本发明公开了一种不同基原黄精的特征降解糖谱鉴定方法，涉及黄精基原鉴定的技术领域。鉴定方法包括如下步骤：黄精多糖提取和纯化，通过单因素考察和正交设计条件优化得到黄精多糖的HPLC特征降解糖谱，样品测定及聚类分析，特征降解糖谱的主成分分析等。对黄精药材的基原进行准确鉴定，进一步保证其临床应用的安全性和有效性，具有良好社会效益和一定的间接经济效益。

技术研发人员：郭怀忠,刘进宝,刘丹
受保护的技术使用者：河北大学
技术研发日：
技术公布日：2024/1/16