一种SD大鼠中KLH的ADA检测方法与流程

本发明涉及生物检测分析，尤其涉及一种sd大鼠中klh的ada检测方法。

背景技术：

1、免疫原性是指如抗原或抗原表位类似功能的能够激发人体或动物产生免疫反应的物质。有害的免疫原性通常与治疗蛋白类药物有很大的关联。当给予蛋白类药物时部分病人会产生抗药抗体(ada)，可能会中和药物的治疗效果并改变药物的药代动力学特征，因此免疫原性的考察是药物研发过程中不可缺少的一个阶段，需要在临床前和临床阶段均开展。

2、血蓝蛋白又称血蓝素(klh)，是一种多功能蛋白，其分子量很大，常常被用来作为刺激机体产生免疫原性的半抗原，用来增强免疫反应。血蓝蛋白检测ada能够判断药物的有效性和安全性，为新药开发、治疗手段及免疫原性分析提供指导意义。

3、对于已报道ada的检测方法通常为elisa桥接法，如中国专利cn115078730a公开了细胞因子融合蛋白的ada分析方法，其主要步骤为：酸化处理样品、将biotin-drug、ada加入至药物包被的96孔酶标板中进行孵育，洗板后在板中加入sa-hrp进行孵育，洗板后加入tmb显色，最后用h2so4终止反应，用酶标仪读取信号值。但是目前市场上还没有抗血蓝蛋白抗体检测的试剂盒及检测方法。因此建立抗血蓝蛋白抗体的ada检测方法有极大的必要性。

技术实现思路

1、本发明所要解决的技术问题是建立降低基质效应、药物耐受性好、操作简单的抗血蓝蛋白抗体的ada检测方法。

2、为了解决上述问题，本发明提出以下技术方案：

3、第一方面，本发明提供一种sd大鼠中klh的ada检测方法，包括以下步骤：

4、s1、制备预设浓度的klh抗原包被的酶标板；

5、s2、将待测样品稀释至预设倍数，向s1得到的酶标板中加入待测样品，温育，洗板；

6、s3、将预设浓度的biotin-klh溶液加入至s2得到的酶标板中，温育，洗板；

7、s4、将sa-hrp稀释至预设倍数，加入至s3得到的酶标板中，温育，洗板；

8、s5、向s4得到的酶标板中加入tmb显色，再加入h2so4终止显色反应，用酶标仪读取信号值。

9、其进一步地技术方案为，所述步骤s1中，klh抗原的浓度为0.2-3.0μg/ml。例如，在其他实施例中，klh抗原的浓度可以是0.2μg/ml、0.5μg/ml、0.8μg/ml、1.0μg/ml、1.5μg/ml、2.0μg/ml、2.5μg/ml或3.0μg/ml。

10、其进一步地技术方案为，所述步骤s2中，待测样品的最低稀释倍数(mrd)为10-60倍。例如，在其他实施例中，待测样品的最低稀释倍数(mrd)可以为10、20、40、50或60。

11、其进一步地技术方案为，所述步骤s3中，biotin-klh溶液的浓度为0.5-1.0μg/ml。例如，在其他实施例中，biotin-klh溶液的浓度可以为0.5μg/ml、0.8μg/ml或1.0μg/ml。

12、其进一步地技术方案为，所述步骤s4中，sa-hrp稀释倍数为1000-4000倍。例如，在其他实施例中，sa-hrp稀释倍数可以为1000倍、2000倍、3000倍或4000倍。

13、其进一步地技术方案为，上述步骤s2-s4中，温育为，在20-40℃，400-800rpm转速下，温育时间1-2h。例如，在其他实施例中，温育的温度为可以为26±1℃、或者37±1℃。

14、其进一步地技术方案为，所述步骤s1的具体操作为：将预设浓度的klh抗原包被液加入酶标板中，90-110μl/孔，封板，将板在2-8℃下孵育12-24h；洗板；然后每孔再加入150-250μl的封闭缓冲液，封板，于室温下温育1～3h，同时400-800rpm振摇；温育结束后洗板，得到所需酶标板。

15、其进一步地技术方案为，所述待测样品、biotin-klh、sa-hrp均是用稀释缓冲液配制至所需浓度，所述稀释缓冲液包括pbst缓冲液、0.01-1.0％赤藓红、0.5-10mg/ml i-block。

16、例如，在一些实施例中，所述稀释缓冲液包括pbst缓冲液、0.1％赤藓红、2.0mg/mli-block。

17、第二方面，本发明提供一种检测sd大鼠中klh的免疫原性分析试剂盒，所述试剂盒包括：

18、组分a：包被有预设浓度klh抗原并形成固相化抗原的酶标板；

19、组分b：biotin-klh溶液；

20、组分c：sa-hrp溶液；

21、组分d：作为阳性质控的含有sd大鼠血清的klh-ada溶液。

22、其进一步地技术方案为，所述试剂盒还包括稀释缓冲液、封闭缓冲液。

23、本发明提供的一种sd大鼠中klh的ada检测方法原理介绍如下：

24、参见图1，本发明是基于酶联免疫吸附试验原理构建检测抗klh抗体的半定量免疫分析方法。首先用klh包被微孔板。封闭后，将处理后的阳性抗体质控样品或待测样品加入到微孔板中。温育后，样品中抗klh抗体被固化的klh捕获。随后将生物素化klh加到微孔板中，形成“固化的klh-抗klh抗体-生物素化klh”复合物。然后将链霉亲和素-hrp加到微孔板孔中，其将与生物素化klh结合。之后，在微孔板中加入四甲基联苯胺(tmb)，tmb在hrp存在下与过氧化物反应形成比色信号(蓝色)。通过向微孔板孔中加入硫酸终止显色，颜色从蓝色变为黄色。在450nm处测量颜色强度(光密度，od)，od值的大小与阳性质控或待检样本中的抗药性抗体浓度呈正相关。

25、与现有技术相比，本发明所能达到的技术效果包括：

26、本发明的提供的一种sd大鼠中klh的ada检测方法，建立了适用于sd大鼠血清中抗血蓝蛋白抗体检测的分析方法。经实验证明，本发明的方法具有良好的精密度和耐药性。本发明的检测方法可以用于血蓝蛋白作为半抗原免疫时，通过对样品中抗血蓝蛋白抗体的反向筛选，从而实现对血蓝蛋白免疫原性强度的检测。本发明的分析方法可以用于对sd大鼠体内对血蓝蛋白免疫原性研究。

技术特征：

1.一种sd大鼠中klh的ada检测方法，其特征在于，包括以下步骤：

2.如权利要求1所述的sd大鼠中klh的ada检测方法，其特征在于，所述步骤s1中，klh抗原的浓度为0.2-3.0μg/ml。

3.如权利要求1所述的sd大鼠中klh的ada检测方法，其特征在于，所述步骤s2中，待测样品的最低稀释倍数为10-60倍。

4.如权利要求1所述的sd大鼠中klh的ada检测方法，其特征在于，所述步骤s3中，biotin-klh溶液的浓度为0.5-1.0μg/ml。

5.如权利要求1所述的sd大鼠中klh的ada检测方法，其特征在于，所述步骤s4中，sa-hrp稀释倍数为1000-4000倍。

6.如权利要求1所述的sd大鼠中klh的ada检测方法，其特征在于，上述步骤s2-s4中，温育为，在20-40℃，400-800rpm转速下，温育时间1-2h。

7.如权利要求1所述的sd大鼠中klh的ada检测方法，其特征在于，所述步骤s1的具体操作为：将预设浓度的klh抗原包被液加入酶标板中，90-110μl/孔，封板，将板在2-8℃下孵育12-24h；洗板；然后每孔再加入150-250μl的封闭缓冲液，封板，于室温下温育1～3h，同时400-800rpm振摇；温育结束后洗板，得到所需酶标板。

8.如权利要求1所述的sd大鼠中klh的ada检测方法，其特征在于，所述待测样品、biotin-klh、sa-hrp均是用稀释缓冲液配制至所需浓度，所述稀释缓冲液包括pbst缓冲液、0.01-1.0％赤藓红、0.5-10mg/ml i-block。

9.一种检测sd大鼠中klh的免疫原性分析试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包括：

10.如权利要求9所述的免疫原性分析试剂盒，其特征在于，所述试剂盒还包括稀释缓冲液、封闭缓冲液。

技术总结
本发明公开了一种SD大鼠中KLH的ADA检测方法，涉及生物检测技术领域。该方法包括：制备预设浓度的KLH抗原包被的酶标板；将待测样品稀释至预设倍数，向酶标板中加入待测样品，温育，洗板；将预设浓度的Biotin‑KLH溶液加入至酶标板中，温育，洗板；将SA‑HRP稀释至预设倍数，加入至酶标板中，温育，洗板；最后向酶标板中加入TMB显色，再加入H<subgt;2</subgt;SO<subgt;4</subgt;终止显色反应，用酶标仪读取信号值。本发明建立了适用于SD大鼠血清中抗血蓝蛋白抗体检测的分析方法，具有良好的精密度和耐药性，可用于对样品中抗血蓝蛋白抗体的反向筛选，从而实现对血蓝蛋白免疫原性强度的检测。

技术研发人员：郭阳阳,李冰,金毅
受保护的技术使用者：安领生物医药（深圳）有限公司
技术研发日：
技术公布日：2024/1/15