抗中性粒细胞胞浆抗体的检测试剂盒及其检测方法与流程

本申请涉及生物，具体而言，涉及一种抗中性粒细胞胞浆抗体的检测试剂盒及其检测方法。

背景技术：

1、抗中性粒细胞胞浆抗体(anti-neutrophil cytoplastic antibodies，anca)代表了一组与中性粒细胞胞浆成分反应的自身抗体。通常anca被认为是与中性粒细胞胞浆中嗜苯胺蓝颗粒和特异性颗粒反应的自身抗体，也能与单核细胞的溶酶体反应。自1985年首次发现anca后，现在anca已成为诊断和治疗系统性血管炎(例如肉芽肿性血管炎gpa和显微镜下多动脉炎mpa)重要的血清学标记物。目前，临床上anca的血清学检测主要用于gpa、快速进行性肾小球肾炎、多发性动脉炎(polyarteritis)、溃疡性结肠炎(ulcerative colitis，uc)和原发性硬化性胆管炎(primary sclerosing cholangitis，psc)及克罗恩病的实验室诊断。

2、目前，临床检测抗中性粒细胞胞浆抗体谱的常见方法主要包括间接免疫荧光法、免疫印迹法、化学发光法、酶联免疫吸附法。免疫荧光法和免疫印迹法存在检测时间长，结果判断难，另外难以标准化和自动化；酶联免疫吸附法，存在操作繁琐，检测项目组合有限；化学发光法不能实现多重检，多重混合检测存在酶本底上升，酶信号值不稳定等问题，上述方法检测抗中性粒细胞胞浆抗体的效率不能满足临床需求。

技术实现思路

1、基于此，本申请提供了一种溶菌酶本底和髓过氧化物酶阳性信号值稳定，测试稳定性好且检测效率高的抗中性粒细胞胞浆抗体的检测试剂盒及其检测方法。

2、具体通过如下的技术方案实现的：

3、本申请一方面提供一种抗中性粒细胞胞浆抗体的检测试剂盒，包括聚合物微球-抗原复合物，荧光素标记的二抗溶液以及保存液；所述抗原包括蛋白酶3、髓过氧化物酶、乳铁蛋白、组织蛋白酶g、弹性蛋白酶、溶菌酶、杀菌通透性增强蛋白和肾小球基底膜；

4、其中所述保存液包括：10mm-100mm缓冲液、0.05m～0.1m盐类物质、1w/v％～5w/v％糖类物质、1w/v％～5w/v％多元醇类物质、0.1w/v％～1w/v％蛋白保护剂、0.05％～0.5％表面活性剂和0.01％～0.1％防腐剂。

5、在其中一些实施例中，所述保存液包括：20mm～50mm hepes缓冲液、0.05m～0.08m氯化钠、2w/v％～3w/v％海藻糖、1.5w/v％～3w/v％甘露醇、0.3w/v％～0.5w/v％牛血清白蛋白、0.05％～0.3％吐温20和0.05％～0.1％防腐剂。

6、在其中一些实施例中，所述保存液还包括0.5m～3m氨基酸类物质和0.2％～0.5％大分子聚合物。

7、在其中一些实施例中，所述保存液满足(1)～(3)中以下至少一个条件：

8、(1)防腐剂包括叠氮钠和proclin中的至少一种；

9、(2)氨基酸类物质包括甘氨酸、谷氨酸和天冬氨酸中的至少一种；

10、(3)大分子聚合物包括peg4000、peg8000和peg12000中的至少一种。

11、在其中一些实施例中，所述荧光素标记的二抗为羊抗人免疫球蛋白igg。

12、在其中一些实施例中，所述荧光素包括藻红蛋白。

13、在其中一些实施例中，所述聚合物微球-抗原复合物的制备方法包括以下步骤：

14、提供聚合物微球，用超纯水进行清洗，加入活化缓冲液进行重悬，固液分离，得到活化后的聚合物微球；

15、将任意一种中性粒细胞胞浆抗原加入所述活化后的聚合物微球中，包被不同中性粒细胞胞浆抗原，需使用不同编码的微球，再使用偶联液进行偶联，加入封闭液及进行封闭，封闭后，固液分离，弃上清，保存在所述保存液中，得到聚合物微球-抗原复合物。

16、本申请另一方面还提供一种检测抗中性粒细胞胞浆抗体的方法，包括以下步骤：取待测样本，使用上述的试剂盒进行抗原-抗体反应，通过对反应产物进行荧光强度检测，分析检测结果。

17、在其中一些实施例中，包括以下步骤：

18、将待测样本和聚合物微球-抗原复合物反应，固液分离，得到聚合物微球-抗原-抗体复合物；

19、将所述聚合物微球-抗原-抗体复合物与荧光素标记的二抗溶液反应，固液分离，得到聚合物微球-抗原-抗体-荧光素标记的二抗复合物；及

20、对所述聚合物微球-抗原-抗体-荧光素标记的二抗复合物进行荧光强度检测，检测抗体是否存在及其浓度。

21、在其中一些实施例中，所述待测样本和所述聚合物微球-抗原复合物、所述聚合物微球-抗原-抗体复合物与所述荧光素标记的二抗溶液的反应温度为37±1℃。

22、本申请通过控制保存液中特定组分及其特定的配比，其中hepes缓冲液可以提供一种稳定的ph条件，提高蛋白质在液体中的稳定性，氯化钠能够提供离子环境，中和抗原抗体电荷，促进结合，海藻糖和甘露醇等能够和蛋白质分子间形成氢键，有利于蛋白质构象稳定性，牛血清白蛋白能够减少环境引起的蛋白质变性，吐温20能提高分散性能，减少蛋白之间互相干扰，提高蛋白稳定性，防腐剂抑制微生物生长，延长试剂保存时间；通过各组分及其配比的协调配合作用，使得检测抗中性粒细胞胞浆抗体的溶菌酶本底和髓过氧化物酶阳性信号值稳定，测试稳定性好且检测效率高。

技术特征：

1.一种抗中性粒细胞胞浆抗体的检测试剂盒，其特征在于，包括聚合物微球-抗原复合物，荧光素标记的二抗溶液以及保存液；所述抗原包括蛋白酶3、髓过氧化物酶、乳铁蛋白、组织蛋白酶g、弹性蛋白酶、溶菌酶、杀菌通透性增强蛋白和肾小球基底膜；

2.如权利要求1所述的检测试剂盒，其特征在于，所述保存液包括：20mm～50mm hepes缓冲液、0.05m～0.08m氯化钠、2w/v％～3w/v％海藻糖、1.5w/v％～3w/v％甘露醇、0.3w/v％～0.5w/v％牛血清白蛋白、0.05％～0.3％吐温20 和0.05％～0.1％防腐剂。

3.如权利要求1所述的检测试剂盒，其特征在于，所述保存液还包括0.5m～3m氨基酸类物质和0.2％～0.5％大分子聚合物。

4.如权利要求3所述的检测试剂盒，其特征在于，所述保存液满足(1)～(3)中以下至少一个条件：

5.如权利要求1～4任一项所述的检测试剂盒，其特征在于，所述荧光素标记的二抗为羊抗人免疫球蛋白igg。

6.如权利要求1～4任一项所述的检测试剂盒，其特征在于，所述荧光素包括藻红蛋白。

7.如权利要求1～4任一项所述的检测试剂盒，其特征在于，所述聚合物微球-抗原复合物的制备方法包括以下步骤：

8.一种检测抗中性粒细胞胞浆抗体的方法，其特征在于，包括以下步骤：取待测样本，使用如权利要求1～7任一项所述的试剂盒进行抗原-抗体反应，通过对反应产物进行荧光强度检测，分析检测结果。

9.如权利要求8所述的方法，其特征在于，包括以下步骤：

10.根据权利要求9所述的方法，其特征在于，所述待测样本和所述聚合物微球-抗原复合物、所述聚合物微球-抗原-抗体复合物与所述荧光素标记的二抗溶液的反应温度为37±1℃。

技术总结
本申请涉及一种抗中性粒细胞胞浆抗体的检测试剂盒及其检测方法。该试剂盒包括聚合物微球‑抗原复合物，荧光素标记的二抗溶液以及保存液；所述抗原包括蛋白酶3、髓过氧化物酶、乳铁蛋白、组织蛋白酶G、弹性蛋白酶、溶菌酶、杀菌通透性增强蛋白和肾小球基底膜；其中所述保存液包括：10mM‑100mM Hepes缓冲液、0.05M～0.1M氯化钠、1w/v％～5w/v％海藻糖、1w/v％～5w/v％甘露醇、0.1w/v％～1w/v％牛血清白蛋白、0.05％～0.5％吐温20和0.01％～0.1％防腐剂。

技术研发人员：王杰,杨月娟,魏道舜,张宇凤,钱纯亘
受保护的技术使用者：深圳市亚辉龙生物科技股份有限公司
技术研发日：
技术公布日：2024/1/15