一种猪尿中兽药多残留的高灵敏度检测方法与流程

本发明属于兽药残留检测，具体涉及一种猪尿中兽药多残留的高灵敏度检测方法。

背景技术：

1、随着规模养殖产业的发展，动物养殖过程中使用兽药较为普遍，例如硝基呋喃类(呋喃西林、呋喃妥因、呋喃它酮、呋喃唑酮)、硝基咪唑类(甲硝唑、地美硝唑、洛硝达唑)、β-激动剂类(克伦特罗、沙丁胺醇、莱克多巴胺)、氯霉素类(氯霉素)和吩噻嗪类(氯丙嗪)等。对兽药残留监测可避免不合格产品流入市场，既保证了食品的安全，也可避免养殖企业的损失，相应的兽药残留检测技术也成为研发的重要领域。

2、现有的兽药残留检测技术为了检测代谢物，往往是根据兽药残留物的性质进行分类别处理，因而主要集中在同类兽药或单一兽药。例如，现有技术(杨俊华,陈海燕,马静,等.hplc测定鱼饲料中硝基呋喃类违禁药物的方法研究[j]宁夏农林科技,2020年第61卷第11期)公开了饲料中呋喃唑酮、呋喃它酮、呋喃西林和呋喃妥因4种硝基呋喃类药物的高效液相色谱分析方法，对鱼饲料进行提取净化后，采用高效液相色谱法进行检测分析。现有技术(李祥波,王亚会.基于hplc-ms/ms的鸡肉中的硝基咪唑类药物残留检测方法的建立[j]食品工业,2021年第42卷第2期)公开了鸡肉中甲硝唑、地美硝唑、左旋咪唑、洛硝达唑的分析方法，用乙酸乙酯提取，提取液经mcx柱净化后采用高效液相色谱-串联三重四极杆质谱法检测分析。现有技术(石静飞.沙丁胺醇和莱克多巴胺在猪和山羊体内的代谢及组织残留预测研究[d]华中农业大学,2014年6月)公开了沙丁胺醇、齐帕特罗、克仑特罗、莱克多巴胺、苯乙醇胺a五种β-受体兴奋剂的定量确证方法，样品采用β-葡萄糖醛酸酶水解，碱化乙酸乙酯超声提取，正己烷去脂，mcx固相萃取柱净化，氨水-甲醇洗脱，氮气吹干，初始流动相复溶，hplc-ms/ms检测。然而，上述现有技术中公开的技术方案均只针对同类兽药或单一兽药的检测，不能实现猪尿中兽药多残留的跨类别检测。

技术实现思路

1、有鉴于此，本发明目的在于提供一种猪尿中兽药多残留的高灵敏度检测方法，采用本发明提供的检测方法对猪尿样品进行检测分析，能够实现呋喃西林代谢物、呋喃妥因代谢物、呋喃它酮代谢物、呋喃唑酮代谢物、克伦特罗、沙丁胺醇、莱克多巴胺、甲硝唑、地美硝唑、洛硝达唑、氯丙嗪和氯霉素12种兽药残留的跨类别检测，弥补了猪尿中兽药残留检测的空缺。

2、为了实现上述目的，本发明采用如下技术方案：

3、本发明提供了一种猪尿中兽药多残留的高灵敏度检测方法，其特征在于，包括以下步骤：

4、将猪尿样品、混合内标液、乙酸铵缓冲溶液和酶解试剂第一混合，进行酶解，得到酶解混合液；

5、将所述酶解混合液、酸解试剂和邻硝基苯甲醛第二混合，进行衍生，得到衍生混合液；

6、将所述衍生混合液和乙酸乙酯第三混合，提取后离心，得到上层液和下层液；

7、依次以水、甲醇和氨水-甲醇混合溶液为洗脱剂对所述下层液进行阳离子交换柱分离，收集氨水-甲醇混合溶液洗脱液，将所述氨水-甲醇混合溶液洗脱液和所述上层液合并，干燥后乙腈水溶液复溶，得到待测样品液；

8、利用液相色谱串联质谱对所述待测样品液进行检测，得到兽药多残留的检测结果；

9、所述兽药多残留包括硝基呋喃类化合物的代谢物、硝基咪唑类化合物、β-激动剂类化合物、氯霉素类化合物和吩噻嗪类化合物中的至少两种。

10、优选的，所述硝基呋喃类化合物的代谢物包括呋喃西林代谢物、呋喃妥因代谢物、呋喃它酮代谢物和呋喃唑酮代谢物中的一种或几种；所述硝基咪唑类化合物包括甲硝唑、地美硝唑和洛硝达唑中的一种或几种；所述β-激动剂类化合物包括克伦特罗、沙丁胺醇、莱克多巴胺中的一种或几种；所述氯霉素类化合物包括氯霉素；所述吩噻嗪类化合物包括氯丙嗪。

11、优选的，所述酶解试剂包括β-葡萄糖醛苷酸酶/芳基硫酸酯酶；所述猪尿样品与酶解试剂的体积比为2：0.02～0.04；所述猪尿样品的体积与乙酸铵的体积之比为2：4～5；所述乙酸铵缓冲溶液的浓度为0.19～0.21mol/l；

12、所述酶解的时间为2～3h。

13、优选的，所述酸解试剂包括盐酸和/或甲酸；所述猪尿样品与酸解试剂的体积比为2：1.4～1.6。

14、优选的，所述猪尿样品的体积与邻硝基苯甲醛的质量之比为2：0.09～0.11。

15、优选的，所述衍生的温度为36～38℃，时间为15～17h。

16、优选的，所述猪尿样品与乙酸乙酯的体积比为2：6～10。

17、优选的，所述阳离子交换柱分离过程中，水的用量为1～1.5bv，甲醇的用量为1～1.5bv，氨水-甲醇混合溶液的用量为1.5～2bv。

18、优选的，所述液相色谱串联质谱的液相色谱检测的条件包括：色谱柱为c18色谱柱；流动相包括流动相a和流动相b，所述流动相a为0.1v/v％甲酸水溶液，所述流动相b为乙腈，所述流动相的流速为0.25～0.3ml/min；柱温为35～40℃；进样量为2～5μl；

19、洗脱方式为梯度洗脱；所述梯度洗脱的程序如下：0.00min，所述流动相a的体积分数为98％；0.00～2.50min，所述流动相a的体积分数由98％降低到95％；2.50～3.00min，所述流动相a的体积分数由95％降低到85％；3.00～5.00min，所述流动相a的体积分数由85％降低到65％；5.00～7.00min，所述流动相a的体积分数由65％降低到45％；7.00～9.00min，所述流动相a的体积分数由45％增加到95％；9.00～11.00min，所述流动相a的体积分数为95％；11.00～11.01min，所述流动相a的体积分数由95％增加到98％；11.01～14.00min，所述流动相a的体积分数为98％。

20、优选的，所述液相色谱串联质谱的质谱检测的条件包括：离子源为电喷雾离子源；检测方式为多反应监测；扫描方式为正负离子扫描；正模式扫描离子源参数：喷雾电压为5500ev；离子源温度为550℃；负模式扫描离子源参数：喷雾电压为-4500ev；离子源温度为550℃。

21、本发明提供了一种猪尿中兽药多残留的检测方法，本发明先对待测样品进行酶解处理，提高了沙丁胺醇和莱克多巴胺的检测灵敏度；然后对待测样品进行酸解衍生处理，可以提高待测化合物中呋喃西林代谢物(amoz)、呋喃妥因代谢物(aoz)、呋喃它酮代谢物(ahd)和呋喃唑酮代谢物(sem)的反相色谱保留性能和质谱离子化效率，灵敏度高，同时改善上述待测化合物的极性，从而提升色谱分离效果，能与基体中干扰物有效分离，也能提高待测物质抗干扰能力，间接的提高了检测灵敏度；克伦特罗、甲硝唑、地美硝唑、洛硝达唑、氯丙嗪和氯霉素主要以游离态为主，检测时不受酶解和酸解衍生影响，可以与上述待测化合物共同检出，本发明提供的检测方法实现了跨类别兽药多残留的高灵敏度检测。

技术特征：

1.一种猪尿中兽药多残留的高灵敏度检测方法，其特征在于，包括以下步骤：

2.根据权利要求1所述的检测方法，其特征在于，所述硝基呋喃类化合物的代谢物包括呋喃西林代谢物、呋喃妥因代谢物、呋喃它酮代谢物和呋喃唑酮代谢物中的一种或几种；所述硝基咪唑类化合物包括甲硝唑、地美硝唑和洛硝达唑中的一种或几种；所述β-激动剂类化合物包括克伦特罗、沙丁胺醇、莱克多巴胺中的一种或几种；所述氯霉素类化合物包括氯霉素；所述吩噻嗪类化合物包括氯丙嗪。

3.根据权利要求1或2所述的检测方法，其特征在于，所述酶解试剂包括β-葡萄糖醛苷酸酶/芳基硫酸酯酶；所述猪尿样品与酶解试剂的体积比为2：0.02～0.04；所述猪尿样品的体积与乙酸铵缓冲溶液的体积之比为2：4～5；所述乙酸铵缓冲溶液的浓度为0.19～0.21mol/l；

4.根据权利要求1所述的检测方法，其特征在于，所述酸解试剂包括盐酸和/或甲酸；所述猪尿样品与酸解试剂的体积比为2：1.4～1.6。

5.根据权利要求1所述的检测方法，其特征在于，所述猪尿样品的体积与邻硝基苯甲醛的体积之比为2：0.09～0.11。

6.根据权利要求1、4或5所述的检测方法，其特征在于，所述衍生的温度为36～38℃，时间为15～17h。

7.根据权利要求1所述的检测方法，其特征在于，所述猪尿样品与乙酸乙酯的体积比为2：6～10。

8.根据权利要求1所述的检测方法，其特征在于，所述阳离子交换柱分离过程中，水的用量为1～1.5bv，甲醇的用量为1～1.5bv，氨水-甲醇混合溶液的用量为1.5～2bv。

9.根据权利要求1所述的检测方法，其特征在于，所述液相色谱串联质谱的液相色谱检测的条件包括：色谱柱为c18色谱柱；流动相包括流动相a和流动相b，所述流动相a为0.1v/v％甲酸水溶液，所述流动相b为乙腈，所述流动相的流速为0.25～0.3ml/min；柱温为35～40℃；进样量为2～5μl；

10.根据权利要求1所述的检测方法，其特征在于，所述液相色谱串联质谱的质谱检测的条件包括：离子源为电喷雾离子源；检测方式为多反应监测；扫描方式为正负离子扫描；正模式扫描离子源参数：喷雾电压为5500ev；离子源温度为550℃；负模式扫描离子源参数：喷雾电压为-4500ev；离子源温度为550℃。

技术总结
本发明提供了一种猪尿中兽药多残留的高灵敏度检测方法，属于兽药残留检测技术领域。本发明先对待测样品进行酶解处理，提高了沙丁胺醇和莱克多巴胺的检测灵敏度；然后对待测样品进行酸解衍生处理，可以提高待测化合物中硝基呋喃类药物的反相色谱保留性能和质谱离子化效率，灵敏度高，同时改善上述待测化合物的极性，从而提升色谱分离效果，能与基体中干扰物有效分离，也能提高待测物质抗干扰能力，间接的提高了检测灵敏度；克伦特罗、甲硝唑、地美硝唑、洛硝达唑、氯丙嗪和氯霉素主要以游离态为主，检测时不受酶解和酸解衍生影响，可以与上述待测化合物共同检出，实现了跨类别兽药多残留的质谱衍生增敏检测。

技术研发人员：万建春,李仕祥,马欣欣,韩颖,占春瑞,马驰远,王佳,伍华雯,吉丽华,邓智伟
受保护的技术使用者：南昌海关技术中心
技术研发日：
技术公布日：2024/1/15