用于诊断早期糖尿病肾病的生物标志物及筛选方法与应用

本发明属于生物医药领域，特别涉及用于诊断早期糖尿病肾病的生物标志物及筛选方法与应用。

背景技术：

1、糖尿病肾病(diabetic kidney disease，dkd)是糖尿病主要的微血管并发症，在中国已经取代慢性肾炎成为慢性肾脏疾病的第一个原因[1,2]。dkd的具体病因仍然是未知的，dkd的病因一般认为是氧化应激的结果，生化代谢紊乱、肾小球血流动力学变化，细胞因子和遗传易感性，但上述发病机理仍不足以解释糖尿病肾病的病理变化[3,4]。以肾素-血管紧张素-醛固酮系统(ras)阻滞剂为基础的综合治疗可以改善dkd患者的病情[5,6]，但并不能完全阻止其进展至终末期肾脏疾病。dkd早期肾小管就发生不同程度的损伤，病变早于肾小球，受损的肾小管可通过多种途径介导肾细胞功能和形态改变[7]。研究表明，糖尿病肾病早期肾小管就发生不同程度的损伤，病变早于肾小球[7]。因此，探索早期肾小管损伤对于筛选早期dkd诊断标志物具有重要的临床意义。

2、外泌体(exosomes)是一种可由机体大多数细胞分泌的微小膜泡，具有直径约30-150nm的脂质双分子层膜结构，可携带和传递蛋白质、dna等重要信号分子，形成与机体免疫反应、抗原提呈和细胞分化、肿瘤生长与侵袭等生物过程广泛相关的新的细胞间通讯系统，与多种疾病的发生进程密切相关[8–11]。肾小膜的膜，携带蛋白质、dna等重要信号转导分子。我们前期研究也发现肾小管上皮细胞分泌的外泌体可以被肾脏成纤维细胞等肾细胞摄取，从而影响肾环境，导致dkd的疾病进展，是糖尿病肾病的不利因素。因此，研究肾小管上皮细胞外泌体的蛋白组成分，会找到某些“dkd特异性的蛋白质分子”，这或许会为dkd疾病的早期诊断提供分子标志。

3、蛋白质是行使细胞功能的主要承担者，蛋白质组直接描述细胞功能和状态，而转录组是研究基因表达的主要手段，是基因组遗传信息与生物功能之间的必要联系，因此，肾小管转录组结合外泌体蛋白组的多组学研究更有利于精确定位dkd的诊断标志物。

4、基于此，本发明提供了一种用于诊断早期糖尿病肾病的生物标志物。将以肾小管外泌体蛋白组学、肾小管转录组学为切入点筛选早期dkd的诊断标志物，通过肾小管外泌体的提取分离纯化得到肾小管外泌体，并进行蛋白质组学；通过geo数据库查找筛选肾小管转录组学数据集gse30122，两者取交集获得22个交集靶点；在r语言的clusterprofiler包中进行交集靶点的go富集分析，在kegg数据库中进行路径富集分析，生物学过程(bp)显示交集靶点参与肾脏系统的发展，kegg富集分析显示交集靶点参与pi3k-akt信号通路；通过r语言构建随机森林模型(rf)、支持向量机模型(svm)和广义线性模型(glm)识别出9个关键靶点，构建roc曲线筛选出auc>0.9的3个关键靶点(cfh、col4a1、anxa2)作为诊断dkd的生物标志物。接着对3个潜在靶点进行差异表达分析和临床相关性验证(egfr，蛋白尿，血肌酐)，验证发现cfh、col4a1、anxa2均有差异表达且与临床相关。结果表明，cfh、col4a1、anxa2为具有潜在诊断意义的靶点，为dkd新的生物标志物的发现提供线索。

技术实现思路

1、本发明的目的在于提供用于诊断早期糖尿病肾病的生物标志物。

2、本发明的另一目的在于提供用于诊断早期糖尿病肾病的生物标志物的筛选方法。

3、本发明的另一目的在于提供用于诊断早期糖尿病肾病的生物标志物在用于制备诊断早期期糖尿病肾病检测试剂盒中的应用。

4、为了实现本发明目的，本发明采用如下技术方案和步骤实现：

5、本发明所述用于诊断早期糖尿病肾病的生物标志物，包括cfh、col4a1、anxa2中任意一种或多种组合。

6、本发明所述生物标志物的样本为肾小管上皮细胞外泌体。

7、本发明所述用于诊断早期糖尿病肾病的生物标志物的筛选方法，包括以下步骤：

8、(1)通过肾小管外泌体的提取分离纯化得到肾小管外泌体，并进行蛋白质组学；

9、(2)通过geo数据库查找筛选肾小管转录组学数据集gse30122；

10、(3)交叉转录组基因和外泌体差异蛋白得到交集靶点，两者取交集获得22个交集靶点；

11、(4)在r语言的clusterprofiler包中进行交集靶点的go富集分析，在kegg数据库中进行路径富集分析，显示交集靶点参与pi3k-akt信号通路，并使用微生信进一步可视化go、kegg富集结果；

12、(5)将交集靶点作为自变量，因变量为是否患有糖尿病肾病，通过r语言构建随机森林模型(rf)、支持向量机模型(svm)和广义线性模型(glm)识别出9个关键靶点，构建roc曲线，筛选出auc大于0.9的3个关键靶点作为诊断dkd的生物标志物。

13、本发明所述3个关键靶点为cfh、col4a1、anxa2。

14、本发明所述的用于诊断早期糖尿病肾病的生物标志物在用于制备诊断早期糖尿病肾病的检测产品中的应用。

15、本发明所述检测产品为检测试剂盒。

16、本发明所述检测试剂盒在制备用于诊断受试者早期糖尿病肾病的产品中的应用。

17、本发明所述检测试剂盒在制备用于筛查受试者早期糖尿病肾病的产品中的应用。

18、本发明所述检测试剂盒在制备用于评估受试者早期糖尿病肾病的产品中的应用。

19、本发明所述检测试剂盒在制备用于早期糖尿病肾病预后评估的产品中的应用。

20、本发明有益效果：

21、1.本发明筛选出的3个关键靶点(cfh、col4a1、anxa2)可作为诊断dkd的生物标志物，有利于临床dkd早期筛查及治疗策略的制定。

22、2.本发明通过肾小管外泌体蛋白组学和转录学等分析筛选出3个有潜在诊断意义的靶点cfh、col4a1、anxa2的auc均在0.9以上，预测能力具有较高准确性。

23、3.本发明对筛选出的3个关键靶点(cfh、col4a1、anxa2)进行差异性表达分析，验证发现cfh、col4a1、anxa2均有显著表达。结果显示cfh、col4a1、anxa2在dkd患者肾小管间质中的表达水平均高于健康活体供者。

技术特征：

1.用于诊断早期糖尿病肾病的生物标志物，其特征在于，所述生物标志物为cfh、col4a1、anxa2中任意一种或多种组合。

2.根据权利要求1所述的用于诊断早期糖尿病肾病的生物标志物，其特征在于，所述生物标志物的样本为肾小管上皮细胞外泌体。

3.一种如权利要求1或2任一项所述的用于诊断早期糖尿病肾病的生物标志物的筛选方法，其特征在于，包括以下步骤：

4.根据权利要求3所述的筛选方法，其特征在于，所述3个关键靶点为cfh、col4a1、anxa2。

5.一种如权利要求1或2任一项所述的用于诊断早期糖尿病肾病的生物标志物的应用，其特征在于，所述生物标志物在用于制备诊断早期糖尿病肾病的检测产品中的应用。

6.根据权利要求5所述的应用，其特征在于，所述检测产品为检测试剂盒。

7.根据权利要求6所述的应用，其特征在于，所述检测试剂盒在制备用于诊断受试者早期糖尿病肾病的产品中的应用。

8.根据权利要求6所述的应用，其特征在于，所述检测试剂盒在制备用于筛查受试者早期糖尿病肾病的产品中的应用。

9.根据权利要求6所述的应用，其特征在于，所述检测试剂盒在制备用于评估受试者早期糖尿病肾病的产品中的应用。

10.根据权利要求6所述的应用，其特征在于，所述检测试剂盒在制备用于早期糖尿病肾病预后评估的产品中的应用。

技术总结
本发明公开了用于诊断早期糖尿病肾病的生物标志物及筛选方法与应用。所述生物标志物包括CFH、COL4A1、ANXA2中任意一种或多种组合。所述筛选方法是通过肾小管外泌体蛋白组学和转录学分析初步筛选出AUC大于0.9的3个关键靶点(CFH、COL4A1、ANXA2)作为诊断DKD的生物标志物。对3个潜在靶点进行差异表达分析和临床相关性验证(eGFR，蛋白尿，血肌酐)，验证发现CFH、COL4A1、ANXA2均有差异表达且与临床相关，具有潜在诊断意义，为DKD新的生物标志物的发现提供线索，对临床DKD早期筛查及治疗策略的制定具有重要意义。

技术研发人员：李军,张楠楠
受保护的技术使用者：贵州中医药大学
技术研发日：
技术公布日：2024/1/16