一种基于单宁酸铜金纳米酶的银杏酸快速检测方法

本发明涉及食品检测领域，具体涉及一种基于单宁酸铜金纳米酶的银杏酸快速检测方法。

背景技术：

1、银杏作为中国特色的林特产品，富含蛋白质、脂质、维生素等营养物质。它们不仅可以加热食用，还可以加工成各种各样的产品，如银杏饼干、银杏罐头、银杏酒等。此外，银杏仁和银杏叶都含有许多生物活性分子，对神经和心血管系统具有保护作用。然而，银杏相关产品中存在一些危及生命的成分，如银杏酸和银杏毒素。其中，银杏酸是最受关注的有害成分之一，过量摄入银杏酸会引起恶心呕吐、腹痛、腹泻或皮疹等毒性症状，严重时可在生物体内产生细胞毒性、免疫毒性、遗传毒性和轻微神经毒性。为了确保银杏相关产品的食用安全，国内外药典规定，银杏相关产品中的银杏酸含量不得超过5mg kg-1。因此，开发一种快速、准确的银杏酸检测方法具有重要意义。目前银杏酸的检测主要集中在色谱法和质谱法，如高效液相色谱、气相色谱、薄层色谱、超临界流体色谱和核磁共振。这些方法通常需要复杂的仪器、专业的操作员和繁琐的准备过程。此外，上述方法普遍存在耗时、昂贵等缺点，且无法实现现场分析。为此，建立一种简单、经济、可靠、高灵敏的银杏酸分析方法具有重要意义。

2、在常规检测方法中，比色法因其简单、方便和肉眼可见而受到青睐。其中，酶联免疫吸附法(elisa)是应用最广的检测方法。由于使用天然酶，天然酶普遍存在成本高、回收率低、稳定性差等问题，这些缺点使得elisa试剂盒容易失活，可能无法准确测定样品。近年来，研究人员一直在关注天然酶的模拟。其中，纳米酶作为一种新型的天然酶模拟物受到了广泛的关注。与天然酶相比，纳米酶具有成本低、稳定性好、回收率高的优点。到目前为止，纳米酶特别是具有过氧化物酶类似活性的纳米酶已广泛应用于食品功能成分、有毒有害物质如农药、抗生素、毒素、细菌等的食品安全检测。基于此，开发基于纳米酶的新型银杏酸检测体系，对于银杏酸的安全开发与利用具有重要意义。

技术实现思路

1、发明目的：为了解决现有技术存在的技术问题，本发明旨在提供一种检测效率高、检测方便且检测灵敏的基于单宁酸铜金纳米酶的银杏酸快速检测方法。

2、技术方案：本发明提供的基于单宁酸铜金纳米酶的银杏酸快速检测方法包括以下步骤：

3、(1)通过自组装制备单宁酸铜金纳米酶：

4、(11)将单宁酸和铜盐溶于水中，混合后调节ph至中性，再加热搅拌反应，结束后离心洗涤冻干得单宁酸铜纳米材料；

5、(12)将氯金酸溶液和溶菌酶溶液一起溶于水中，混合后调节ph至碱性，再搅拌反应，结束后得金纳米簇溶液；

6、(13)将单宁酸铜纳米材料和金纳米簇溶液一起溶于水中，充分搅拌反应后，结束后离心洗涤冻干得单宁酸铜金纳米酶；

7、(2)构建银杏酸检测平台：

8、(21)配制待检测溶液：将单宁酸铜金纳米酶、双氧水、3,3',5,5'-四甲基联苯胺和银杏酸溶解于磷酸盐缓冲液中，充分反应得待检测溶液；

9、(22)银杏酸的定量分析：采用智能手机收集含有不同浓度银杏酸的待检测溶液的颜色，再采用imagej软件将收集到的不同颜色转换为rgb值，接着将rgb值转换为(r+g)/2b来代表不同银杏酸浓度，根据(r+g)/2b与不同银杏酸浓度，得到银杏酸的线性方程。

10、进一步地，步骤(11)中，所述单宁酸和铜盐的质量比为1:30-1:40，所述铜盐为五水硫酸铜，单宁酸在水中的质量浓度为0.5-1.0mg/ml；所述中性的ph为7.4；所述加热的温度为40-70℃，搅拌反应的时间为2-5h。

11、进一步地，步骤(12)中，所述氯金酸溶液的浓度为50-100mm，溶菌酶溶液的浓度为5-10mm，所述氯金酸溶液、溶菌酶溶液和水的体积比为1:2:50-1:2:100，优选为1:2:96；所述碱性的ph值为10-13；所述搅拌反应的条件为：25-40℃下反应12-24h。

12、进一步地，步骤(13)中，所述单宁酸铜纳米材料、金纳米簇溶液和水的用量比为3mg:1.4ml:1.6-2ml，优选为3mg:1.4ml:1.6ml；所述搅拌反应的条件为：室温下反应0.5-2h。

13、进一步地，步骤(21)中，所述磷酸盐缓冲液的ph为4.0-7.0，优选为4.0；所述待检测溶液中，单宁酸铜金纳米酶的浓度为0.1-20μg/ml，双氧水的浓度为10-30mm，3,3',5,5'-四甲基联苯胺的浓度为1-4mm；优选的，单宁酸铜金纳米酶的浓度为0.2μg/ml，双氧水的浓度为25mm，3,3',5,5'-四甲基联苯胺的浓度为1mm。

14、进一步地，步骤(21)中，所述反应的条件为：30-60℃下反应5-30min。

15、进一步地，步骤(22)中，所述银杏酸浓度为0.5-20μg/ml。

16、发明原理：本发明合成的单宁酸铜金纳米酶由单宁酸铜纳米材料和金纳米簇通过自组装制备得到，选择过渡金属中的铜和金作为催化活性中心，制得的单宁酸铜金纳米材料具有过氧化物酶类似的催化活性，可催化双氧水氧化底物3,3',5,5'-四甲基联苯胺生成蓝色产物，产物在652nm处有特征吸收峰；在银杏酸存在时，银杏酸抑制单宁酸铜金纳米酶的催化活性，导致652nm处吸收强度减弱。因此，利用银杏酸对单宁酸铜金纳米酶催化活性的影响，本发明可用于银杏酸的比色检测；鉴于反应体系颜色的变化可以通过智能手机进行捕获，其对应的颜色变化可以通过imagej图像处理软件进行处理，进而根据颜色变化与银杏酸浓度的关系，进行银杏酸的定量检测。

17、有益效果：与现有技术相比，本发明具有以下显著优点：

18、(1)本发明通过绿色合成方法，将单宁酸铜纳米材料与金纳米簇进行组装，构建得到新型单宁酸铜金纳米材料，证实其具有增强的过氧化物酶催化活性；

19、(2)本发明利用银杏酸对单宁酸铜金纳米酶催化活性的影响，结合智能手机和imagej图像处理软件，提出银杏酸的快速检测新方法，检测范围为0.5-20μg/ml，检测限为0.87μg/ml。检测限与传统色谱法在同一数量级，但可有效缩短检测时间；

20、(3)本发明检测方法抗干扰能力强，可实现复杂食品样品中银杏酸的快速检测。

技术特征：

1.一种基于单宁酸铜金纳米酶的银杏酸快速检测方法，其特征在于，包括以下步骤：

2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤(11)中，所述单宁酸和铜盐的质量比为1:30-1:40，所述铜盐为五水硫酸铜，单宁酸在水中的质量浓度为0.5-1.0mg/ml。

3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤(11)中，所述加热的温度为40-70℃，搅拌反应的时间为2-5h。

4.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤(12)中，所述氯金酸溶液的浓度为50-100mm，溶菌酶溶液的浓度为5-10mm，所述氯金酸溶液、溶菌酶溶液和水的体积比为1:2:50-1:2:100；所述搅拌反应的条件为：25-40℃下反应12-24h。

5.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤(13)中，所述单宁酸铜纳米材料、金纳米簇溶液和水的用量比为3mg:1.4ml:1.6-2ml；所述搅拌反应的条件为：室温下反应0.5-2h。

6.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤(21)中，所述磷酸盐缓冲液的ph为4.0-7.0。

7.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤(21)中，所述待检测溶液中，单宁酸铜金纳米酶的浓度为0.1-20μg/ml，双氧水的浓度为10-30mm，3,3',5,5'-四甲基联苯胺的浓度为1-4mm。

8.根据权利要求6所述的方法，其特征在于，所述待检测溶液中，单宁酸铜金纳米酶的浓度为0.2μg/ml，双氧水的浓度为25mm，3,3',5,5'-四甲基联苯胺的浓度为1mm。

9.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤(21)中，所述反应的条件为：30-60℃下反应5-30min。

10.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤(22)中，所述银杏酸浓度为0.5-20μg/ml。

技术总结
本发明公开了一种基于单宁酸铜金纳米酶的银杏酸快速检测方法，属于食品检测领域。上述检测方法包括以下步骤：(1)通过自组装制备单宁酸铜金纳米酶；(2)构建银杏酸快速检测平台。本发明通过将单宁酸铜纳米材料和金纳米簇组装制得的单宁酸铜金纳米材料具有增强的过氧化物酶催化活性，能够催化双氧水氧化底物3,3',5,5'‑四甲基联苯胺使其显色，可实现增强的放大检测效果，银杏酸可与单宁酸铜金的活性位点结合，抑制其过氧化物酶活性，结合智能手机和ImageJ图像处理软件实现银杏酸的便携式、快速检测。与传统的色谱法相比，该比色法检测限在同一数量级，但能够有效缩短检测时间。

技术研发人员：黄燕燕,钟慧敏,姜聪,邹佳辉,朱冠成
受保护的技术使用者：南京林业大学
技术研发日：
技术公布日：2024/2/1